[發明專利]產丁二酸基因工程菌及其構建及應用

有效

• 申請號: 201210392834.2
• 申請日: 2012-10-16
• 公開（公告）號: CN102864116A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發明（設計）人: 姜岷;陳旭;梁麗亞;萬青;茍冬梅;劉嶸明;馬江鋒
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P7/46;C12R1/19
• 代理公司: 江蘇致邦律師事務所 32230
• 代理人: 徐蓓

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，涉及產丁二酸基因工程菌及其構建及應用，具體涉及一種高效利用葡萄糖生長并產丁二酸基因工程菌Escherichia?coli?BA016的構建及其生產丁二酸的方法。

背景技術

丁二酸，俗稱琥珀酸，作為一種常見的天然有機酸，廣泛存在于動植物和微生物中，許多厭氧微生物生產丁二酸作為其能量代謝的主要末端產物。作為一種優秀的C4平臺化合物，丁二酸可被廣泛用于藥物、精細化工產品以及可生物降解的聚合物的前提，美國能源部的報告將丁二酸列為未來12種最有潛力的生物基大宗化學品中的第一位.。許多厭氧微生物能夠生產丁二酸作為其能量代謝的主要末端產物。傳統丁二酸化學合成法采用以不可再生的戰略資源石油作為原料，環境污染嚴重，無法實現可持續發展。利用生物轉化法轉化可再生資源來生產丁二酸，成本低，污染小，環境友好，且在發酵過程中可吸收大量的CO₂，有效減輕溫室效應，近年來受到了各國科研人員的關注。在眾多的琥珀酸生產菌中，大腸桿菌具有培養條件簡單、代謝網絡明確、易改造、易操作等特點，已成為生物法合成丁二酸的研究熱點。

現有的產丁二酸大腸桿菌基因改造策略主要有增強代謝途徑中的關鍵酶（如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PCK）、失活或敲除競爭途徑中的酶（如乳酸脫氫酶LDH、丙酮酸甲酸裂解酶PFL）、引入新的代謝途徑（如乙醛酸循環）等。其中，E.?coli?NZN111由于同時失活了丙酮酸甲酸裂解酶與乳酸脫氫酶，丙酮酸的代謝支路大大減少，丙酮酸大量積累，最終導致厭氧條件下菌株不能利用葡萄糖。其自發突變株E.?coli?AFP111由于突變了葡萄糖專性轉運系統中的ptsG基因，菌株使用葡萄糖激酶系統進行葡萄糖的轉運，使丙酮酸的積累不再是糖轉運的限制因素，恢復了菌株在厭氧條件下利用葡萄糖的能力，且產物主要為丁二酸，在有氧厭氧兩階段發酵培養AFP111過程中，丁二酸質量收率達到96%，生產強度為1.21?g·L^-1·h^-1。因此，在高產丁二酸大腸桿菌菌株構建過程中，減少丙酮酸的積累是重組大腸桿菌高產丁二酸的關鍵因素之一。

大腸桿菌中NAD(H)的生物合成及分解途徑如圖1所示，涉及其合成的基因主要有三個（pncB，nadD，nadE），涉及分解代謝的基因主要有兩個（yjaD，yrfE），而NAD⁺和NADH相互之間的轉化反應則多達300多個。相關研究表明，利用DNA重組技術改造NAD(H)生物合成途徑是提高NAD(H)總量的有效手段。E.?coli?NZN111由于同時失活了丙酮酸甲酸裂解酶與乳酸脫氫酶，NADH不能及時再生為NAD⁺，引起胞內輔酶NAD(H)的不平衡（NADH/NAD⁺比例超過2），最終導致厭氧條件下菌株不能利用葡萄糖。因此，在高產丁二酸大腸桿菌菌株構建過程中，確保胞內輔酶NAD(H)的平衡是重組大腸桿菌高產丁二酸的關鍵因素之一。San等人（Metab?Eng,?2002,?4:?238-247；Metab?Eng,?2002,?4:?182-192）在研究輔因子調控對大腸桿菌代謝流分布的影響過程中，通過過量表達煙酸轉磷酸核糖激酶使胞內NAD(H)總量提高了41.7%；Heuser等人（Eng?Life?Sci,?2007,?7:?343-353）通過過量表達煙酸轉磷酸核糖激酶和NAD合成酶，或者同時表達這兩個酶，使菌株胞內NAD(H)總量提高了2倍多，并將其應用到酶轉化合成(R)-甲基-3-羥基丁胺過程中，使得NAD(H)的量不再成為限制因素，從而提高了酶轉化的效率。