[發明專利]環境水體中人類腸道病毒與非人類腸道病毒含量檢測方法

無效

• 申請號: 201210392715.7
• 申請日: 2012-10-15
• 公開（公告）號: CN102888469A
• 公開（公告）日: 2013-01-23
• 發明（設計）人: 周進宏;王曉昌;張崇淼;船水尚行;佐野大輔
• 申請（專利權）人: 西安建筑科技大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 西安恒泰知識產權代理事務所 61216
• 代理人: 史玫

技術領域

本發明屬于環境水體質量的檢測技術領域，具體涉及一種環境水體中人類腸道病毒與非人類腸道病毒含量檢測方法。

背景技術

腸道病毒是廣泛存在于水源水及污染水中，不斷引起水媒病毒傳染病的暴發流行。病毒的檢測方法主要有：組織培養法、免疫學方法、分子生物學方法等。其中，組織培養法培養周期長，有些病毒缺乏敏感的細胞系來培養或無明顯細胞病變效應；免疫學檢測方法需要較高濃度的病毒樣品，環境水樣濃縮后，也不易達到所需濃度；分子生物學方法多利用核酸的檢測，因其檢測時間短，檢測限低靈敏度高，精確度高，已得到廣泛的應用。

環境水體中腸道病毒屬宿主迥異，種類復雜濃度低，現有的關于環境水體中腸道病毒的PCR檢測方法大多是定性或定量的檢測總腸道病毒，來源于人類分泌物或排泄物的腸道病毒的檢測很少有研究涉及。因環境水體水質復雜同時存在很多PCR反應抑制劑和其他雜質，導致現有檢測方法存在靈敏度不夠高、受雜質干擾影響較大、無法準確定量的缺點。目前還沒有科學的用于對環境水體中人類腸道病毒和非人類腸道病毒含量進行檢測的方法。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供一種環境水體中人類腸道病毒與非人類腸道病毒含量檢測方法。

為此，本發明提供的環境水體中人類腸道病毒與非人類腸道病毒含量檢測方法按下述步驟進行：

步驟一，樣品處理：

（1）樣品采集：采集待檢測水樣后于4℃條件下保存；

（2）病毒濃縮：于V?mL的待檢測水樣中加入質量百分比為8%的聚乙二醇（PEG-6000）和質量百分比為2.3%的氯化鈉（NaCl）；接著將待檢測水樣在100rpm、4℃條件下攪拌12小時；然后將待檢測水樣在9000g，4℃條件下離心30分鐘，棄上清液，用1mL超純水重懸沉淀得到病毒濃縮液，其中50≤V≤250；

（3）RNA提取：使用RNA提取試劑盒從病毒濃縮液中提取RNA；

（4）逆轉錄：將5μL的RNA、2μL的5xgDNA?Eraser?Buffer、1μL的5xgDNA?Eraser?Buffer和2μL的RNase?Free?dH₂O在42℃條件下反應2min得到反應液，將該反應液與4μL的Buffer、1μL的RT?Enzyme?Mix、1μL的RT?Primer?Mix和4μL的RNase?Free?dH₂O混合進行如下反應：先在37℃條件下反應15min；接著在85℃條件下反應5s；得到cDNA，并將所得cDNA在-80℃條件下保存；步驟二，標準品制備：

（1）第一輪PCR擴增：以步驟一獲得的cDNA為模板，利用上游引物EVR-F1和下游引物EVR-R1進行PCR擴增，得到第一輪擴增后的PCR產物，其中：

上游引物EVR-F1的核苷酸序列為：

5’-CCCCTGAATGCGGCTAATCC-3’；

下游引物EVR-R1的核苷酸序列為：

5’-CAATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’；

（2）第二輪PCR擴增：以第一輪擴增后的PCR產物為模板，利用上游引物EVR-F2和下游引物EVR-R2進行PCR擴增，得到第二輪擴增后的PCR產物，其中：

上游引物EVR-F2的核苷酸序列為：

5’-GTAACGGGCAACTCTGCAGC-3’；

下游引物EVR-R2的核苷酸序列為：

5’-ATTGTCACCATAAGCAGCCA-3’；

（3）將所得的第二輪擴增后的PCR產物電泳膠純化回收目的片段，得到目的片段產物，該目的片段產物的長度為m（bp）；

（4）首先將目的片段產物與pMD19-T載體連接轉化至大腸桿菌DH5α中，篩選出轉化進插入目的片段的載體的菌落，將該陽性菌在含有卡那霉素的LB液體培養基中于37℃條件下培養12~16小時得到菌液，其中卡那霉素的質量濃度為50μg/mL；然后用質粒提取試劑盒從菌液中提取質粒；接著采用雙脫氧終止法對得到的質粒的核苷酸序列進行測定，將所測得的核苷酸序列在NCBI基因庫經BLAST比對，當所測得的核苷酸序列與人類腸道病毒基因相似度大于等于90%時，提取的質粒為標準品；當所測得的核酸序列與人類腸道病毒基因相似度小于90%時，重復步驟（4），直至提取的質粒為標準品；

（5）檢測標準品的OD₂₆₀值n；

（6）利用（式1）計算標準品濃度C（copies/μL）：