[發(fā)明專利]葉片直接PCR法及其在轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)中的應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210392513.2
• 申請(qǐng)日: 2012-10-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102876664A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-01-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 任雯;劉亞;趙久然;陳浩;周秒依
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京市農(nóng)林科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;任鳳華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種PCR擴(kuò)增方法及其應(yīng)用，特別涉及一種以葉片直接作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法，以及該方法在轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

目前，針對(duì)轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)的方法有很多種，主要基于不同檢測(cè)目的，可分為以下幾類：首先，檢測(cè)目的為鑒定外源基因整合與否及其整合拷貝數(shù)時(shí)可使用常規(guī)PCR檢測(cè)法、多重PCR法（Multiplex?PCR，也稱為MPCR）、降落PCR法（Touchdown?PCR，TD-PCR）、反向PCR法（inverse?PCR，IPCR）、以及Southern雜交檢測(cè)法等等。其次，針對(duì)外源基因在轉(zhuǎn)化植株中是否轉(zhuǎn)錄的檢測(cè)與鑒定，可通過(guò)Northern雜交和實(shí)時(shí)定量PCR等方法進(jìn)行檢測(cè)。此外，檢測(cè)與鑒定轉(zhuǎn)基因植株外源基因表達(dá)情況時(shí)可使用Elisa檢測(cè)和Westhern雜交等方法。其中常規(guī)PCR法以其快速、準(zhǔn)確、可重復(fù)性高等特點(diǎn)已成為轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中應(yīng)用最為普遍的方法。

為了適應(yīng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的快速發(fā)展，提高檢測(cè)檢測(cè)效率，國(guó)內(nèi)外都涌現(xiàn)出了大量基于PCR技術(shù)的檢測(cè)方法，其中，武海斌（武海斌，路興波，孫紅煒等.轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化體特異性PCR檢測(cè)技術(shù)研究[J].玉米科學(xué)，2009,17(1)60-70.武海斌，孫紅煒，李寶篤等.轉(zhuǎn)基因玉米多重PCR-基因芯片聯(lián)用的檢測(cè)方法[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2009,17(6):1075-1082.）等建立了一種將多重PCR與基因芯片結(jié)合的檢測(cè)方法，其特點(diǎn)在于較高的準(zhǔn)確性和靈敏度。而金蕪軍（金蕪軍，郝旸，程紅梅等.用復(fù)合PCR方法檢測(cè)6種轉(zhuǎn)基因玉米中外源DNA的特異性[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2005,13(5):562-567.）等則利用復(fù)合PCR的方法對(duì)不同轉(zhuǎn)基因玉米中的外源DNA片段和玉米內(nèi)參基因（zein）進(jìn)行特異性檢測(cè)。目前隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，多種多樣針對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)革新使得PCR實(shí)驗(yàn)可實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單快捷的規(guī)?；僮?，大大節(jié)省了人力物力和時(shí)間成本。而在轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)過(guò)程中使用最為普遍的常規(guī)PCR法檢測(cè)中制備DNA模板不僅是檢測(cè)的第一步，也是保證檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確與否的基礎(chǔ)。目前主要使用CTAB法、SDS法等方法（Matsuoka?T,Kuribara?H,Akiyama?H,et?al.A?multiplex?PCR?method?of?detecting?recombinant?DNAs?from?five?lines?of?genetically?modified?maize.Journal?of?Food?and?Hygiene?Society?of?Japan,2001,42:24~32.）由待測(cè)樣品中提取DNA作為PCR反應(yīng)模板，這些方法操作復(fù)雜，提取時(shí)間較長(zhǎng)，同時(shí)提取液中含有的苯酚，氯仿等試劑易對(duì)環(huán)境造成污染。在大規(guī)模檢測(cè)中，DNA模板的提取已成為檢測(cè)環(huán)節(jié)中耗時(shí)耗力最多的一個(gè)環(huán)節(jié)。特別是在轉(zhuǎn)基因植物的回交轉(zhuǎn)育過(guò)程中，需要進(jìn)行大量的樣本檢測(cè)，而從田間取材獲得的大量的葉片在長(zhǎng)途的運(yùn)輸過(guò)程中要如何保證樣品中的核酸不被降解，是一個(gè)相當(dāng)棘手的問(wèn)題，而往往消耗大量人力、物力和財(cái)力進(jìn)行葉片的運(yùn)輸和保藏后進(jìn)行檢測(cè)的效果不盡理想。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種葉片直接PCR法及其在轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)中的應(yīng)用。

本發(fā)明所提供的葉片直接PCR法是將植物葉片直接作為模板，采用Phire熱啟動(dòng)II?DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增的方法。

在所述方法中，所述葉片可為幼嫩葉片。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述幼嫩葉片具體為暗室中發(fā)芽的玉米黃化苗（苗高5~8cm），或大田中正常培育的玉米4-5葉期之前葉片，或番茄自種子萌發(fā)后第一片真葉出現(xiàn)至花蕾顯現(xiàn)時(shí)的葉片。

為了達(dá)到更加理想的PCR效果，所述葉片在PCR反應(yīng)體系中可以葉片面積小于等于0.2平方毫米的組織塊的形式存在，足以保證有足夠的葉片創(chuàng)面與PCR反應(yīng)體系溶液充分接觸。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述PCR反應(yīng)體系中的所述葉片是用打孔器打出的直徑為0.5mm的葉片組織塊。

實(shí)際操作中，最好使所述葉片懸浮在所述PCR反應(yīng)體系中，如果所述葉片貼壁則會(huì)影響PCR反應(yīng)結(jié)果。