[發明專利]一種基于DNA折紙的生物分子親和常數測定方法

無效

• 申請號: 201210391472.5
• 申請日: 2012-10-15
• 公開（公告）號: CN102955047A
• 公開（公告）日: 2013-03-06
• 發明（設計）人: 樊友杰;李賓;吳娜;胡鈞
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海應用物理研究所
• 主分類號: G01Q60/34
• 分類號: G01Q60/34
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 鐘華;沈利

技術領域

本發明屬于檢測方法領域，特別涉及一種基于DNA折紙的生物分子親和常數的測定方法。

背景技術

抗體的親和力（affinity）是指抗原與抗體結合的牢固程度。親和力越大表示抗體的結合反應越快，抗原抗體復合物越不易解離?？贵w親和力是抗體的結合部位與相應抗原決定簇之間的非共價引力與斥力之和，它是評價抗體質量的重要指標?？贵w親和力的大小以親和常數表示，親和力常數（K）是抗原/抗體結合反應的平衡常數。

目前，測定親和常數的方法有多種，如：硫氰酸鹽洗脫法、尿素洗脫法、ELISA法、生物傳感器法、表面等離子共振法和競爭結合法等。上述測定方法主要建立在宏觀的統計數據基礎上，目前還無單分子水平上的測定方法。

親和常數的測定是基于如下的結合解離作用定理，如下列化學式所示：

反應達到平衡時，其親和常數計算方法如下列數學式所示：

K=[AbAg]/[Ag][Ab]

其中，[Ag]代表游離抗原濃度，[Ab]代表游離抗體濃度，[AbAg]代表抗原抗體復合物濃度，K為親和常數。

傳統的測定親和常數的方法不能從上述數學式中直接測定親和常數，因為無法確定反應中的游離抗原和游離抗體濃度，所以需變換公式進行測定。傳統測定方法通常設定其中一組分濃度遠遠小于另外一組分濃度，如抗原濃度遠遠小于抗體濃度。這樣，反應達到平衡時，就可以認為抗體總濃度為游離抗體濃度，帶入變換后的公式計算。目前應用較多的測定生物分子親和常數的方法主要為酶聯免疫分析法（ELISA）和表面等離子體共振法（SPR）。ELISA是測定OD值來計算親和常數，SPR是計算K_b（結合速率常數）和K_d（解離速率常數）來測定親和常數K，這兩種方法的背景噪聲相對來說比都較大，測定過程也相對比較復雜。因此，傳統的測定方法不僅需要消耗大量的抗原、抗體，而且實驗設定的條件較多，步驟較繁瑣而復雜，引入的誤差也相對較大。

DNA折紙術是最近幾年得到迅猛發展的納米技術，利用一條長的單鏈DNA（腳手架鏈，通常為M13mp18）與相配對的200多條寡核苷酸鏈(訂書訂鏈)短鏈自組裝而成。通過設計不同的寡核苷酸鏈，可使DNA組裝成不同的納米結構，其結構具有圖案可控和編碼可循的特征。由于個寡核苷酸鏈末端可被多種分子修飾，所以在DNA折紙界面上的反應位點具有精確可控的優勢。原子力顯微鏡（AFM)具有納米級的分辨率，通過檢測折紙上特定位置的形貌變化就能夠準確判斷反應變化的情況，如反應是否發生，以及反應速度快慢等，能夠在單分子水平上研究生物分子形貌和分子間相互作用力。

發明內容

因此，本發明要解決的技術問題就是針對現有的生物分子親和常數測定方法無法做到在單分子水平上進行測定，而且實驗設定的條件較多，步驟繁瑣而復雜，引入的誤差也相對較大的問題，利用DNA折紙具有反應位點精確可控的優勢以及原子力顯微鏡（AFM）可以在反應界面上直接觀察單個抗原抗體分子復合物的優勢，提供一種基于DNA折紙的生物分子的親和常數測定方法。

為解決上述技術問題，本發明采取的技術方案之一是：一種基于DNA折紙的生物分子的親和常數測定方法，其中所述生物分子包括能夠彼此結合與解離的反應物Ⅰ和反應物Ⅱ，該測定方法包括以下步驟：

（1）將反應物Ⅰ連接于DNA折紙訂書釘鏈末端，然后和腳手架鏈自組裝形成DNA折紙；

（2）加入反應物Ⅱ，反應達到平衡后利用原子力顯微鏡掃描成像收集數據，計算出反應物I和反應物Ⅱ復合物的濃度[AbAg]，游離的反應物Ⅰ的濃度[Ag]以及游離的反應物Ⅱ的濃度[Ab]；

（3）將步驟（2）所得數值代入如下公式，K＝[AbAg]/[Ag][Ab]，計算得到所述反應物Ⅰ和反應物Ⅱ的親和常數K。

其中所述生物分子為本領域常規的單分子之間可發生結合與解離的一對生物分子。所述的生物分子較佳地包括反應物Ⅰ和與之特異性結合的反應物Ⅱ，所述反應物Ⅰ和與之特異性結合的反應物Ⅱ較佳地包括以下各組分子中的一組或多組：抗原和抗體，生物素和親和素，核酸適配體及其靶分子以及配體和受體。其中還包括已知的其他可以發生特異性結合并且具有親和常數的物質，這些都在本發明的保護范圍之內。例如：可與DNA適配體或RNA適配體相結合的蛋白質、多糖和多肽等物質。本發明所述反應物I和反應物Ⅱ優選地為地高辛和地高辛抗體。