[發明專利]一種色氨酸及血清樣本中游離色氨酸含量的檢測方法

有效

• 申請號: 201210390766.6
• 申請日: 2012-10-16
• 公開（公告）號: CN102914527A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發明（設計）人: 何成;王健;武鵬彥;劉曉花;段然
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C07F5/00;C09K11/06
• 代理公司: 大連星海專利事務所 21208
• 代理人: 王樹本

技術領域

本發明涉及一種游離色氨酸含量的檢測方法,更具體地說,涉及一種色氨酸及血清樣本中游離色氨酸含量的檢測方法。

背景技術

在天然的20種氨基酸中，色氨酸具有至關重要的意義，例如血清中色氨酸含量的非正常偏高被認為是某些疾病產生的關鍵影響要素，如慢性肝炎、帕金森病、再生障礙性貧血和肌肉萎縮等。所以發展有效地在活體內識別和檢測色氨酸含量，尤其是應用于血清樣本中色氨酸含量的檢測方法具有臨床上的意義。

然而，設計合成出具有高選擇性和有效地識別該類重要的生物小分子的探針在目前是一個極具挑戰的課題，經過科學工作者數十年的不懈努力，氨基酸分子熒光探針在基礎理論研究方面取得了巨大的進步,?實現了對特定目標氨基酸的高選擇性的檢測。但是，目前絕大部分的氨基酸識別探針要真正應用到現實生產生活中，科學工作者還需解決如下問題：

1.?基于弱作用識別過程對氨基酸的識別，其中提高識別過程的選擇性是重點，因為氨基酸及其衍生物都具有相似的結構，從而具有相同的弱作用識別位點，達到對單一氨基酸分子的識別在目前的研究中還有待解決。

2.?現在大部分高選擇性的氨基酸探針都是基于共價鍵反應型機理，對于氨基酸的識別過程同時也伴隨著氨基酸分子結構的變化，識別過程不可逆，不利于現實意義上的檢測應用。?

3.?小肽和蛋白質對氨基酸識別過程的干擾目前研究的較少，大部分生物樣本中都會含有氨基酸、小肽和蛋白質，真正的構筑研究生命體系生物小分子的探針刻不容緩。

發明內容

為了解決上述現有技術中存在的問題，本發明目的是提供一種色氨酸及血清樣本中游離色氨酸含量的檢測方法。具體是將具有藍色熒光發射的三苯胺基團作為熒光團和芳香堆積作用位點，協同天然的酰胺基團作為氫鍵授受體，構筑具有特殊親疏水空腔的四面體籠狀結構，不僅可以在20種天然氨基酸中高選擇性的識別色氨酸，小肽的存在對熒光識別過程沒有干擾，而且還將其應用到生物活體細胞成像研究，最為有利的是實現了對血清樣本中游離色氨酸含量的熒光法檢測，通過熒光定量檢測生物體內的色氨酸。

為了實現上述發明目的,本發明采取的技術方案是：一種色氨酸及血清樣本中游離色氨酸含量的檢測方法，所述探針為含有式A的配合物，

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式A中，L為含有三苯胺基團作為熒光團，功能酰胺基團作為氫鍵作用位點的配體，具有如下B分子結構式；

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（B）

M為鈰?(Ce³⁺)?金屬離子，m和n分別為金屬和配體的個數，其中m=n=4組裝為四面體結構。

所述一種色氨酸及血清樣本中游離色氨酸含量的檢測方法，包括以下步驟：

（a）、按照熒光法對于色氨酸的識別方法；

????稱取根據權利要求1所述的探針材料，配制成cM的100?ml有機/水混合溶劑的標準探針溶液，再配置2.0×10^-2?M的色氨酸有機/水混合溶劑的溶液。量取標準探針溶液2?ml，向其中逐漸加入上述配制的色氨酸溶液，至色氨酸含量達到7.5?mM后，熒光增強直至平衡。

（b）、按照熒光法對色氨酸的選擇性識別測試方法；

取探針材料c?M，加入色氨酸達到7.5?mM，其它19種天然氨基酸，包括Ile,?Arg，Ala，Val，Leu，Pro，Met，Thr，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Ser，Gly，Cys，His，Phe和Tyr分別加入15?mM，同時，含有5個色氨酸殘基的13肽?(ILPWKWPWW?PWRR-NH2)?加入80?mM，在350?nm處激發，測試其熒光發射譜圖。

（c）、按照熒光法得到色氨酸含量的標準曲線方法；

稱取根據權利要求1所述的探針材料，配制成c?M的100?ml有機/水混合溶劑的標準探針溶液，再配置2.0×10^-2?M的色氨酸有機/水混合溶劑的溶液。量取標準探針溶液2?ml，加入計算量的色氨酸溶液，配制成標準測試溶液。上述溶液在350?nm處激發，測得熒光發射譜圖，然后以色氨酸的加入量為橫坐標，相對熒光強度為縱坐標，得到標準曲線。

（d）、熒光法直接檢測血清樣本中色氨酸含量的技術；

??血清樣本從合作醫院取來后，未經任何處理，直接用微量注射器加入到