[發明專利]聚乙二醇化殼聚糖在作為核酸載體中的應用

有效

• 申請號: 201210390105.3
• 申請日: 2012-10-15
• 公開（公告）號: CN103725713A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 杜立波;劉揚;高艷利;賈宏瑛
• 申請（專利權）人: 中國科學院化學研究所
• 主分類號: C12N15/87
• 分類號: C12N15/87;C12N15/85;A61K48/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及一種聚乙二醇化殼聚糖的新用途，特別涉及O-羥乙基殼聚糖體在作為核酸載體中的應用。

背景技術

基因治療是指運用DNA技術來實現治療人類疾病的一種治療方法。近年來，基因治療的發展使得一些遺傳性疾病或癌癥的治愈成為可能。目前，應用最為廣泛的用于基因治療的載體就是病毒載體，如逆轉錄病毒，腺病毒，痘苗病毒等。但這些病毒類載體在臨床應用中存在著很大的安全隱患。因此，尋找安全、有效、無免疫原性的非病毒類載體就成為目前關注的熱點之一。

非病毒載體主要分為陽離子聚合物和陽離子脂質體兩大類。陽離子聚合物具有如下優點：（1）提供與DNA自組裝的動力，有利于保護DNA免受降解；（2）壓縮DNA成為比DNA體積小的復合物顆粒，有利于進入細胞；（3）使復合物顆粒之間產生靜電排斥作用，穩定復合物；（4）與細胞膜產生靜電吸附作用，促進復合物內吞。盡管已有陽離子聚合物聚乙烯亞胺（PEI）應用于體內外轉染的應用出現，但是PEI與DNA所形成的復合物由于帶有過剩的正電荷，會給細胞帶來急性及延遲的毒副作用，而且該轉染試劑的轉染效率也不夠高，這些缺點大大影響了其在臨床上的應用。

為解決上述問題，急需一種在轉染效率、細胞毒性方面均有改進的非病毒類轉染載體的出現。

發明內容

本發明的目的是提供一種聚乙二醇化殼聚糖的新用途。

本發明所提供的聚乙二醇化殼聚糖的新用途，具體為如式Ⅰ所示的聚乙二醇化殼聚糖在制備核酸載體中的應用，

式Ⅰ

所述式Ⅰ中，n為10-20的整數，x為3-7的整數，y為2-10的整數。

當然，如所述式Ⅰ所示的聚乙二醇化殼聚糖在作為核酸載體中的應用也屬于本發明的保護范圍。

在上述兩應用中，所述載體運載所述核酸進入宿主細胞。

本發明的另一個目的是提供一種體外轉染細胞的方法。

本發明所提供的體外轉染細胞的方法具體可包括如下步驟：

（1）將如所述式Ⅰ所示的聚乙二醇化殼聚糖與待轉染核酸按照質量比為0.1-100：1的比例混合形成復合物；

（2）將步驟（1）所得的復合物導入目的細胞。

在上述方法中，所述細胞具體為動物來源的細胞，當然也包括人來源的細胞。在本發明的一個實施例中，所述細胞具體為HEK293細胞（人胚腎細胞）、NIH3T3細胞（小鼠胚胎成纖維細胞）和HeLa細胞（人宮頸癌細胞）。

如所述式Ⅰ所示的聚乙二醇化殼聚糖與核酸所形成的復合物在制備治療相應疾病的產品中的應用也屬于本發明的保護范圍。

上述應用中，所述相應疾病為用所述核酸進行基因治療的疾病；所述復合物中，所述聚乙二醇化殼聚糖與所述核酸的質量比為0.1-100：1（如10：1）。

所述聚乙二醇化殼聚糖與核酸所形成的復合物的制備方法也屬于本發明的保護范圍。

該方法可包括將所述如式Ⅰ所示的聚乙二醇化殼聚糖與核酸按照質量比為0.1-100：1（如10：1）的比例混合后并孵育的步驟。

在上述各應用及方法中，所述式Ⅰ中，x均具體可為5，y均具體可為5，n均具體可為8。

在上述所述聚乙二醇化殼聚糖與核酸所形成的復合物的制備方法中，所述孵育的溫度可為20-25℃，所述孵育的時間可為10-30分鐘

具體的，所述復合物均可按照包括如下步驟的方法制備：

（1）將所述如式Ⅰ所示的聚乙二醇化殼聚糖的水溶液用孔徑為0.22μm的微孔濾膜過濾，獲得無菌的聚乙二醇化殼聚糖水溶液；

（2）將步驟（1）獲得的聚乙二醇化殼聚糖水溶液與無菌的核酸水溶液，按照所述聚乙二醇化殼聚糖與所述核酸的質量比為0.1-100：1的比例混合，獲得混合溶液；

（3）將步驟（2）所得的混合溶液置于20-25℃孵育10-30分鐘，獲得所述如式Ⅰ所示的聚乙二醇化殼聚糖與核酸所形成的復合物。

在本發明的一個實施例中，步驟（2）中所述聚乙二醇化殼聚糖與所述核酸的質量比具體為10：1；步驟（3）中進行孵育的具體溫度為室溫（25℃），孵育的具體時間為10分鐘。

由上述方法制備得到的所述復合物也屬于本發明的保護范圍。

所述如式Ⅰ所示的聚乙二醇化殼聚糖與核酸所形成的復合物的顆粒直徑為20-100nm，表面電位為+5mV至+60mV。

在轉染過程中，表面帶正電的所述復合物與細胞表面帶負電的蛋白多糖相互作用，并通過內吞作用進入細胞。