[發(fā)明專利]發(fā)酵法木聚糖酶的一種制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210388616.1
• 申請日: 2012-10-15
• 公開（公告）號: CN103436522A
• 公開（公告）日: 2013-12-11
• 發(fā)明（設計）人: 李林香;潘莉
• 申請（專利權(quán)）人: 合肥朗肽生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N15/01
• 分類號: C12N15/01;C12N9/42;C12R1/01
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及高產(chǎn)木聚糖酶菌株的誘變選育及利用該菌株發(fā)酵制備高活性木聚糖酶的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

國外對木聚糖酶的研究較早，應用與生產(chǎn)技術(shù)已逐漸趨向成熟，細菌、真菌和放線菌木聚糖酶都得到了廣泛而深入的關(guān)注和研究，并且在1992年就已實現(xiàn)了木聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)。目前，國外對木聚糖酶的研究已達到了分子水平，研究工作主要集中在對微生物木聚糖酶的誘導與調(diào)節(jié)機理研究，以及酶的提純、鑒定方法、木聚糖酶基因分子的克隆和表達等。自上世紀七十年代末開展木聚糖酶基因的研究工作以來，已有150多種來自真菌和細菌的木聚糖酶基因被克隆并在大腸桿菌中表達。

我國在木聚糖酶方面的研究起步較晚，但發(fā)展迅速。目前，我國對木聚糖酶的研究大多停留在產(chǎn)酶菌株的篩選和馴化、木聚糖酶的純化和理化性質(zhì)研究方面，部分課題已涉及木聚糖酶的分子生物學研究、木聚糖酶基因克隆、表達和重組。不同菌株產(chǎn)木聚糖酶的能力存在差異，對木聚糖酶分離提純工藝開展深入細致的研究，為我國木聚糖酶制劑生成提供新的酶源。上世紀八十年代初期，中國科學院微生物所在張樹政院士的帶領(lǐng)下，開始了我國對木聚糖酶的早期研究工作，首次從海棗曲酶(Aspergillus?phoenicis)中純化得到了四種木聚糖酶：酶I、酶II、酶III和酶IV，并深入研究了活力較高的組分酶III的酶學性質(zhì)。山東大學微生物系國家重點實驗室研究獲得產(chǎn)酸性木聚糖酶的菌株黑曲霉An-76和產(chǎn)堿性木聚糖酶的菌株嗜堿細菌Cb-2，搖床試驗產(chǎn)木聚糖酶分別為350u/mL和300u/mL。無錫江南大學早在2000年就已報道：經(jīng)UV和NTG方法誘變篩選出一株假單細胞菌，命名為WLUN024，發(fā)酵初始PH6.5-8.5，發(fā)酵最適溫度37℃。

木聚糖酶的純化技術(shù)與純度是決定其生產(chǎn)成本及市場競爭力的重要因素。在傳統(tǒng)工藝中，微生物產(chǎn)木聚糖酶大部分是通過色譜法得到純化。雖然色譜法具有較高的分辨率，但多步純化耗時、回收率低，不適合高純度木聚糖酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。目前，研究者在研究基于雙水相純化技術(shù)(Aqueous?Two-Phase?System，ATPS)的衍生技術(shù)、三相分離體系(Three-phase?partitioning，TPP)和擴張床吸附技術(shù)(Expanded?bed?adsorption，EBD)。Aparna等通過TPP純化Aspergillus?niger木聚糖酶，活性回收率達60％，純化倍數(shù)達95倍。Roy等先將Aspergillus?niger木聚糖酶用8M尿素/100mM二硫蘇糖醇變性，再進行TPP純化，木聚糖酶達到了93％的活性回收率和21倍純化，且實現(xiàn)了該酶變性后的復性。Santos等嘗試用擴張床吸附技術(shù)純化木聚糖酶，雖然最大只有21.8％的活性回收率和30倍純化，但該技術(shù)有經(jīng)濟、省時、木聚糖酶發(fā)酵液不需沉淀澄清等優(yōu)點。

隨著基因突變技術(shù)和蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)研究技術(shù)的進展，大量性質(zhì)各異的木聚糖酶，尤其是在極端微生物中獲得的具有極端性質(zhì)的木聚糖酶，有望使木聚糖酶的結(jié)構(gòu)與功能研究取得突破性進展。可以預期，在微生物學、生物化學、細胞生物學、分子生物學、動物營養(yǎng)學等學科的協(xié)作下，不久的將來，性能更加優(yōu)良，技術(shù)更加成熟，使用更加有效，效益更加明顯的木聚糖酶將在飼料、食品、造紙、紡織、醫(yī)藥及能源等領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

目前，木聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)與廣泛應用還受到制約，如應用在紙漿漂白過程中的木聚糖酶需要具有耐高溫、耐堿以及分子量低的特性，但絕大多數(shù)微生物的木聚糖酶為中低溫或偏酸性，在工業(yè)應用上收到了很大限制。當前構(gòu)建木聚糖酶基因工程高產(chǎn)菌至今尚未取得突破性進展，因此，采用傳統(tǒng)的物理或化學方法進行誘變育種以及尋找合適的發(fā)酵工藝條件，仍然是發(fā)酵法生產(chǎn)木聚糖酶和改變其性質(zhì)應用于工業(yè)化生產(chǎn)的重要手段之一。

本發(fā)明采用現(xiàn)代誘變育種方法，在短時間內(nèi)篩選出一株產(chǎn)木聚糖酶酶量高且性能穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株，研究該高產(chǎn)菌株生產(chǎn)木聚糖酶的發(fā)酵工藝和分離純化工藝，為進一步開發(fā)和利用木聚糖酶提供科學依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種由微生物菌種發(fā)酵液產(chǎn)生、分離純化制備高酶活木聚糖酶的新工藝。

本發(fā)明所述的木聚糖酶的制備方法由如下步驟組成：

1、高產(chǎn)菌株的選育