[發明專利]一種分子標記輔助選育豇豆耐旱品種的方法

有效

• 申請號: 201210388129.5
• 申請日: 2012-10-11
• 公開（公告）號: CN102864242A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發明（設計）人: 徐沛;李國景;吳曉花;汪寶根;黃蕓萍;魯忠富;王毓洪;王莎
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 杭州豐禾專利事務所有限公司 33214
• 代理人: 沈伾伾

技術領域

本發明屬于作物育種生物技術領域，尤其屬于利用分子標記輔助選育豇豆耐旱品種的方法。

背景技術

長豇豆是我國重要的夏季豆類蔬菜，深受人民群眾喜愛。然而豇豆主要種植于夏秋高溫干旱季節，全國范圍內尤其是北方地區豇豆生產中面臨著干旱的巨大威脅。干旱脅迫會造成豇豆大量落花落莢和形成“鼠尾化”豆莢，產量損失巨大，品質下降嚴重。當前廣大豇豆種植者對耐旱性強的優良長豇豆品種的渴求非常迫切（Agbicodo?et?al.,?2009）。因此，改良栽培長豇豆的耐旱性是我國長豇豆育種上亟待解決的重大問題之一。

但是植物包括豇豆的耐旱性屬于受多基因控制的復雜性狀，其育種改良較為困難。盡管可以通過田間或溫室進行苗期或成株期的耐旱鑒定，但是該方法需要大量土地和人力資源，而且耗時費力，對于大量基因型材料的篩選很不現實。目前，豇豆的育種手段仍以常規育種為主。分子標記輔助選擇（molecular?marker-assisted?selection，簡稱MAS）是現代分子生物學與傳統遺傳育種學相結合的技術。MAS借助分子標記對育種材料從DNA水平上進行選擇，從而可以快速選擇得到具有目的性狀的后代(方宣鈞等，2001)。通過追蹤與耐旱基因關聯的分子標記，不但能在遺傳背景不同的育種分離后代中特異性檢測目的基因是否存在，而且可以在任一生育階段的同時對多個性狀基因進行篩選。MAS方法迅速、穩定、可靠，不受其它效應和環境因素的影響，可使育種家擺脫對表型性狀鑒定的依賴，在早世代進行選擇，從而大大提高育種效率。應用MAS，理論上只要回交3代就可以選擇到理想的材料。因此，研究開發實用性強、成本低、準確性高的與豇豆耐旱基因關聯的分子標記，就可以顯著加快豇豆耐旱育種速度，提高選擇的效率和準確性，極具應用價值。

????近年來，國內外研究機構已在豇豆上開發了大量的SNP、SSR等標記，有力促進了豇豆分子育種工作（Xu?et?al.,?2010）。SNP?(single?nucleotide?polymorphism)?即單核苷酸多態性，是指在某種生物不同個體DNA序列中存在的單個核苷酸變異。SNP是基因組中最豐富的遺傳多態，同時SNP也是最易進行自動化、高通量檢測的標記之一。SNP技術已經大量成功地用于遺傳多樣性研究、遺傳圖譜構建、基因定位等研究。然而，由于SNP標記難于通過PCR檢測，因此在育種實踐中通常難于直接利用。當SNP的存在引起酶切位點改變時，通過在SNP位點兩側設計引物可將SNP轉化為基于PCR的，使用較為方便的酶切擴增多態性序列標記（C1eaved?Amplified?Polymorphic?Sequences，CAPS）。利用CAPS引物擴增目標基因片段，經相應限制性內切酶酶切后可以揭示原SNP位點的DNA多態性。利用由SNP轉化的CAPS標記，育種家已在番茄、辣椒等蔬菜作物上成功進行了應用（李紅等，2007；王立浩等，2006）。

發明內容

????本發明目的是：針對豇豆常規育種方法中單純依靠田間或溫室進行苗期或成株期耐旱鑒定所存在的需要大量土地和人力資源及耗時費力等的缺陷，提供一種省時、省力、準確、快捷的分子標記輔助豇豆耐旱品種的選育方法。

本發明目的通過以下技術方案來實現：

一種分子標記輔助選育豇豆耐旱品種的方法，該方法按以下步驟進行：

????（1）豇豆耐旱關聯SNP分子標記位點1_1286的篩選：用Qiagen公司的植物DNA小量提取試劑盒依說明書所述方法提取耐旱性程度各異的99份豇豆品系的DNA；利用豇豆?Kaspar?SNP?基因型檢測平臺通過芯片雜交檢測每份DNA上各1127個SNP位點的基因型，并按缺失信號率<20%，低豐度等位型即MAF值?<?0.1的標準去除低質量的SNP位點，最終保留422個SNP位點的基因型數據并被用于標記-性狀關聯分析；將上述422個SNP位點的基因型數據與同上所述99份豇豆品系歷年溫室耐旱性鑒定獲得的莖桿綠色程度值Stg，按Tassel軟件的MLM的混合線性模型進行關聯分析，從中獲得與Stg顯著關聯的P<0.001的SNP標記1_1286；上述溫室耐旱性鑒定方法為：對發芽后正常生長20-24天開始甩蔓的植株終止澆水造成人工干旱脅迫，停水14天后對各份種質材料以其Stg即莖桿持綠色性為指標，按以下分級標準進行記載、統計：0級：莖桿正常，無失綠；1級：￡20%莖桿失綠；2級：20%-40%莖桿失綠；3級：40%-60%莖桿失綠；4級：60%-80%莖桿失綠；5級：>80%莖桿失綠至完全枯黃；?