[發明專利]一組雞Cathelicidins抗菌肽及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 201210387660.0
• 申請日: 2010-12-22
• 公開（公告）號: CN102864154A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發明（設計）人: 吳靜;宋敏訓;李玉峰;馬秀麗;姜亦飛;黃兵;林樹乾;于可響
• 申請（專利權）人: 山東省農業科學院家禽研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/465;C12N15/63;C12N15/70;A61K38/17;A61P31/04;A61P31/10
• 代理公司: 濟南誠智商標專利事務所有限公司 37105
• 代理人: 韓百翠

1.雞抗菌肽Cathelicidin3，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.6所述。

2.雞抗菌肽Cathelicidin3，其特征是，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.10所述。

3.如權利要求1或2所述的雞抗菌肽Cathelicidin3的制備方法，其特征是，所述制備方法為固相化學合成法或基因工程方法，所述基因工程方法是將雞抗菌肽Cathelicidin3的編碼基因克隆到表達載體上，然后導入宿主細胞中表達；所述表達載體為質粒或病毒中的一種，所述宿主細胞為原核細胞或真核細胞。

4.如權利要求3所述的雞抗菌肽Cathelicidin3的制備方法，其特征是，所述基因工程方法為：

（1）將雞抗菌肽Cathelicidin3成熟肽的編碼基因克隆到大腸桿菌融合表達載體pET30a(+)中，得到融合表達載體pET30-CathL3S；

（2）將pET30-CathL3S質粒轉化大腸桿菌Rosetta(DE3)菌株，得到重組大腸桿菌基因工程菌株；

（3）37℃下，在LB培養基中，誘導物IPTG濃度為1.0mmol/L的條件下，對上述重組大腸桿菌基因工程菌進行誘導表達3小時；

（4）離心收集上述表達菌體，超聲波破碎，分離細胞可溶組分與包涵體；

（5）Ni²⁺-NTA?Sepharose4B親和層析柱純化融合蛋白。

5.如權利要求4所述的雞抗菌肽Cathelicidin3的制備方法，其特征是，

（1）PCR方法擴增編碼雞抗菌肽Cathelicidin3成熟肽的核苷酸序列，PCR產物經EcoR?I和Xho?I雙酶切后與同樣酶切的pET-30a(+)融合表達載體連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，提取質粒，應用PCR和質粒酶切的方法篩選陽性克隆，通過DNA測序驗證插入片段閱讀框的正確性，從而構建出原核表達載體；將構建的融合表達載體命名為pET30-CathL3S；

（2）將測序正確的質粒pET30-CathL3S轉化大腸桿菌Rosetta(DE3)菌株，獲得重組表達Cathelicidins3成熟肽融合蛋白的工程菌Rosetta(DE3)/pET30-CathL3S；挑取工程菌單菌落接種至LB培養基中37℃培養8~12h；次日離心取菌體重懸至新鮮LB培養基中，待培養液OD_600nm值達到0.5~0.6時加入IPTG使其終濃度為1.0mmol/L，開始進行誘導；37℃繼續培養4h，每隔1小時取樣1mL；離心收集誘導培養后的菌體，用PBS緩沖液洗滌菌體2次，再加入裂解緩沖液，冰浴中超聲破碎菌體，每次破碎5s，間隔2s，功率600W，破碎10min；超聲后12000r/min，4℃下離心10min，分離可溶組分與和包涵體，進行SDS-PAGE電泳和Western?Blot檢測；電泳后將SDS-PAGE凝膠中的條帶電轉移至硝酸纖維素膜上，以鼠抗His單克隆抗體為一抗，羊抗鼠IgG-HRP為二抗，DAB為顯色底物進行Western-blot分析，鑒定表達產物；

（3）然后進行工程菌擴大培養和目的蛋白的誘導表達，條件為：25℃、IPTG濃度為1.0mmol/L的條件下誘導培養8小時；取誘導后的菌體，加入結合緩沖液，冰浴中超聲波破碎菌體，分離包涵體和可溶組分，將裂解上清液上樣于Ni²⁺-NTA?Sepharose?4B親和層析柱，樣品經含0.1~0.5mol/L咪唑的緩沖液梯度洗脫，收集融合蛋白洗脫峰進行SDS-PAGE檢測。

6.如權利要求5所述的雞抗菌肽Cathelicidin3的制備方法，其特征是，所述步驟（1）擴增編碼雞抗菌肽Cathelicidin3成熟肽的核苷酸序列的引物為CathL3S?F/R，其中F為正向引物，R為反向引物，所述CathL3S?F/R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.17-18所述。