[發(fā)明專利]一種納米級生物復(fù)合物及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210386999.9
• 申請日: 2012-10-12
• 公開（公告）號: CN103728283A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 江婷婷;蒲洋;秦松;崔玉琳;王寅初
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N33/66;A61B5/1455
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)，具體涉及一種納米級生物復(fù)合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

葡萄糖，作為主要碳源和能源，在我們?nèi)粘Ｉ钕嚓P(guān)的各個方面起到了重要的作用。缺乏葡萄糖會抑制細(xì)胞的生長和分裂，或限制食品工業(yè)生物過程中產(chǎn)品的產(chǎn)量。但是，過多的葡萄糖也可以通過糖酵解途徑誘發(fā)乳酸的形成。因此，監(jiān)測和控制血糖水平，不僅對健康的細(xì)胞的生長十分必要，也可作為糖尿病的臨床指標(biāo)，同時對于監(jiān)控工業(yè)中生物過程的最大產(chǎn)量有著十分顯著的作用。一直以來尋找“理想”的葡萄糖傳感器，是許多研究者的一個長期目標(biāo)，現(xiàn)今已經(jīng)開發(fā)了大量的葡萄糖傳感器。然而，這些葡萄糖傳感系統(tǒng)有一些內(nèi)在的不足，如：傳感器的制作再現(xiàn)性低，生物相容性較低，貯存穩(wěn)定性較弱以及傳感器信號的不可逆。因此，可靠的葡萄糖傳感器特別是能被植入體內(nèi)，長時間監(jiān)測葡萄糖的生理水平的傳感器仍然是非常必要的。

帶有麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽和組氨酸標(biāo)簽的重組別藻藍(lán)蛋白結(jié)合一個色基，由來自于Synechocystis?sp.PCC6803基因組α亞基基因通過在N末端依次添加組氨酸標(biāo)簽和麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽，并在大腸桿菌宿主中表達(dá)。融合的His6-標(biāo)簽提供了一種簡便的方法，易于大規(guī)模的從細(xì)胞裂解物中純化重組的別藻藍(lán)蛋白。同時也順利完成了大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)重組別藻藍(lán)蛋白。

最近，石墨烯作為一種新型的熒光淬滅基團以及碳納米管的替代品，獲得了越來越多的研究。殼聚糖修飾的石墨烯片材的表面上含有大量的羧基，羥基，和環(huán)氧基團，使材料具有更好的水溶性，也使其更易于與其它分子形成共價鍵。帶有麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽和組氨酸標(biāo)簽并結(jié)合一個色基的重組別藻藍(lán)蛋白α亞基可以與殼聚糖修飾的石墨烯通過麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽相結(jié)合。這種結(jié)合在體外可以引起重組別藻藍(lán)蛋白α亞基的熒光淬滅。然而在葡萄糖存在的條件下，通過競爭性結(jié)合，在葡萄糖與麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽更強的結(jié)合親和力作用下，對殼聚糖修飾的石墨烯進(jìn)行替換使熒光信號得以恢復(fù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供一種納米級生物復(fù)合物及其應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用技術(shù)方案為：

一種納米級生物復(fù)合物，納米級生物復(fù)合物為0.02微克/毫升—10微克/毫升的納米級氧化石墨烯-低分子量殼聚糖復(fù)合物溶液和0.001毫克/毫升—10毫克/毫升的帶有麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽和組氨酸標(biāo)簽的重組別藻藍(lán)蛋白溶液共混于PBS溶液。

所述納米級氧化石墨烯-低分子量殼聚糖復(fù)合物溶液為

將片狀石墨加入到純硫酸、過硫酸鉀和五氧化二磷混合液于60-100℃溫育3-10小時得預(yù)氧化石墨；

于0-4℃下將上述預(yù)氧化石墨加入純硫酸中，并在10-25℃恒溫下邊攪拌邊逐漸加入高錳酸鉀，加入后在15-45℃攪拌1-5小時，而后加入蒸餾水用以終止反應(yīng)，反應(yīng)終止后加入過氧化氫，待反應(yīng)液變?yōu)榱咙S色進(jìn)行離心，而后經(jīng)HCl溶液洗滌沉淀，離心所得沉淀經(jīng)蒸餾水洗滌并離心，沉淀再用蒸餾洗滌，重復(fù)多次直至洗滌沉淀的蒸餾水的pH值變?yōu)橹行裕?/p>

將上述洗滌至中性混濁液經(jīng)超聲處理并離心，上清液再經(jīng)超聲處理即得納米級（20-20000納米粒徑）氧化石墨的片層，所得片層經(jīng)Tris-HCl緩沖液溶解并加入1-乙基-3（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺（EDC）于室溫下攪拌混勻加入低分子量（分子量為9×10³-7×10⁵）殼聚糖，即得到納米級氧化石墨烯-低分子量殼聚糖復(fù)合物溶液。

所述重組別藻藍(lán)蛋白溶液為帶有麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽和組氨酸標(biāo)簽的重組別藻藍(lán)蛋白α亞基溶液。

納米級生物復(fù)合物的應(yīng)用，所述納米級生物復(fù)合物作為生物傳感器。所述納米級生物復(fù)合物作為檢測單糖的生物傳感器。所述納米級生物復(fù)合物作為檢測葡萄糖的生物傳感器。所述生物傳感器可用于血液中生化指標(biāo)或食品藥品中的葡萄糖含量的檢測。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點：

1.采用本發(fā)明納米級生物復(fù)合物作為傳感器進(jìn)行血糖濃度監(jiān)測。其制作再現(xiàn)性高，生物相容性較高，貯存穩(wěn)定性較強并且傳感器信號具有可逆性。本發(fā)明納米級生物復(fù)合物是可靠的葡萄糖傳感器，特別是能被植入體內(nèi)長期監(jiān)測葡萄糖的生理水平。

2.本發(fā)明納米級生物復(fù)合物中帶有麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽和組氨酸標(biāo)簽的重組別藻藍(lán)蛋白α亞基結(jié)合一個色基，具有生物相容性，無毒，長期穩(wěn)定和640nm近紅外熒光發(fā)射等特性。納米級生物復(fù)合物含有組織吸收極低的發(fā)色團，進(jìn)而將發(fā)射光通過兩厘米厚的組織傳播，更加便于檢測其熒光信號，配合高度敏感的檢測技術(shù)，可以提供更深入的實時組織的監(jiān)測。