[發明專利]一種棘白菌素B的分離純化方法和用途

有效

• 申請號: 201210386298.5
• 申請日: 2012-10-12
• 公開（公告）號: CN103724403B
• 公開（公告）日: 2018-02-16
• 發明（設計）人: 袁建棟;劉明川;郭明;張杰
• 申請（專利權）人: 重慶乾泰生物醫藥有限公司
• 主分類號: C07K7/56
• 分類號: C07K7/56;C07K1/36;C07K1/20;A61K38/12;A61P31/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于藥物化學領域，具體涉及一種棘白菌素B從發酵液中分離的方法及其用途。

背景技術

棘白菌素類（Echinocandins）是70年代末期發現的一組天然產物，具有類似的環狀多肽核心和不同的脂肪酸側鏈的結構特征，能夠非競爭性抑制真菌細胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶活性，臨床上作為抗真菌藥物使用。

棘白菌素B（Echinocandin B,簡稱ECB）由構巢曲霉（Aspergilus nidulans）代謝產生，是棘白菌素類中的一種，其結構如下：

棘白菌素B經脫酰酶作用得到環肽母核，環肽母核再經過化學修飾可制備得到抗真菌藥物阿尼芬凈（Anidulafungin）。為了提高ECB脫酰效率和ECB母核質量，需要對發酵液中的ECB進行分離純化，發酵液HPLC圖譜見附圖1。

現有技術中對棘白菌素B的分離技術大多通過大孔樹脂和硅膠層析法進行分離，如美國專利US4968608公開了一種用大孔樹脂HP20、葡聚糖凝膠LH20和正相硅膠從發酵液中分離純化得到ECB的方法，該方法步驟繁瑣、所使用分離介質價格昂貴且對含油酸甲酯超過2%的發酵菌絲浸提液適應性差；美國專利US6506726對此進行改進，將發酵液酸化后使用HP20、SP825、SP207和CG-161等大孔樹脂分離提純ECB，該方法比較簡便但分離效果不好，產品純度低于80%，也存在對含油酸甲酯超過2%的發酵菌絲浸提液適應性差得缺點。同時美國專利US4288549 中也公開了一種采用過硅膠柱，萃取等方法純化棘白菌素B的方法，但是此方法需要在較大的壓力條件下進行，導致制備工藝難以放大，且對上游發酵液中的色素不能很好的去除。棘白菌素B中所含雜質成分過高必將導致其經脫酰酶作用得到的環肽母核質量降低，進而影響以其為有效成分的抗菌藥物的質量。

所以迫切需要一種適應性強、純度和收率高、操作簡便又經濟的從發酵液中分離棘白菌素B的方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種棘白菌素B及其從發酵液中分離的方法，該方法包括如下步驟：

步驟1）：酸化棘白菌素B 的發酵液并過濾取菌絲體；

所述的酸化是指使用弱酸，調節發酵液pH為4-6。

所述的弱酸為草酸、碳酸或醋酸，優選為草酸；調節發酵液pH為4-6，優選調節發酵液pH為5。

所述的酸化過程中，可以添加助濾劑，添加的量為菌絲質量的5%-15%，優選為10%。

所述的助濾劑為珍珠巖、微分硅膠、滑石粉或麥子淀粉，優選為珍珠巖。適當的添加助濾劑以減小菌絲體之間的摩擦力，改善溶液的流動性，便于菌絲體更充分的被過濾獲取。

優選的，可以在將菌絲體過濾后用水洗滌，并進一步干燥獲得。

更進一步的，步驟1）優選為向發酵液中加入質量為菌絲質量10%的助濾劑，再加入適量酸化劑調節發酵液 pH為4-6，攪拌1-3小時；過濾，用水洗滌菌絲體，干燥后收集菌絲體。

步驟2）：將菌絲體用有機溶劑浸提，過濾并濃縮濾液；

所述的有機溶劑選自醇或酮中的一種或其任意兩種或兩種以上的溶劑組合。

所述的醇為甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇、乙二醇或1,3-丙二醇，優選為甲醇或乙醇；所述酮為丙酮、丁酮或戊酮。

所述的浸提過程中使用的有機溶劑質量為菌絲體質量的2-4倍，優選3倍；邊攪拌邊浸泡菌絲體3-8小時后，優選4-6小時，再過濾收集濾液。

進一步的，浸提過程可重復1-3次，優選2次，以達到充分提取、減少溶劑殘留和節約成本的目的。

所述的濃縮是在溫度小于50 ℃，真空度為-0.08～-0.09 Mpa條件下進行，濃縮至溶液中有機溶劑含量小于30%。

更進一步的，步驟2）優選為取質量為過濾所得菌絲體質量的3倍的有機溶劑浸泡菌絲體，邊攪拌邊浸泡4-6小時后過濾收集濾液，再次用質量為經浸提后的菌絲體質量的2-3倍的有機溶劑邊攪拌邊浸泡3-5小時，再過濾，收集濾液，合并兩次濾液；減壓濃縮濾液，使溶液中的有機溶劑含量小于30%。

步驟3）：將濾液經萃取劑萃取除去油酸甲酯，收集有機層溶液并濃縮；

所述的萃取是指用體積為凝縮液體積5%-30%的萃取劑，優選10%；萃取1-3次，優選2次。

所述的萃取劑為石油醚、正己烷或正庚烷，優選為石油醚。

所述的濃縮是指經萃取后收集有機層溶液35℃-70℃下，優選為40-50℃，濃縮至有機層溶液體積的25%以下，優選10%以下。