[發明專利]一種產異丁醇的運動發酵單胞菌基因工程菌及其構建方法

有效

• 申請號: 201210386012.3
• 申請日: 2012-10-12
• 公開（公告）號: CN102876625A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 高強;朱燕;孟慶艷;潘超強
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12R1/01
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

技術領域

本發明屬于生物基因工程技術領域，涉及基因工程菌株及其構建方法，具體的是一種產異丁醇的基因工程菌及其構建方法。

背景技術

異丁醇是一種典型的長鏈醇，相對于燃料乙醇而言具有高能量密度、低腐蝕性、低吸濕性、更易與汽油和柴油混合以及與現今的設備更好的相容性等特點。因此，異丁醇成為潛在的新型可再生能源替代品和燃料添加劑。異丁醇除了作為一種潛在的新型汽油代替燃料外，目前在化工市場上也有很多用途。生物質作為一種來源豐富的綠色可再生資源，可以廣泛用做發酵制備多種化學品的原料，因此通過可再生資源代謝生成異丁醇有著具有良好的發展前景。

過去的研究表明沒有原核生物能夠由葡萄糖合成異丁醇，現在研究人員通過一定的基因工程技術對一些宿主菌進行改造從而獲得合成異丁醇的能力。目前，以大腸桿菌、谷氨酸棒狀桿菌、枯草芽孢桿菌等細菌為宿主產異丁醇的研究已有很大的突破。其中，Antonino?Baez等在2011年應用1L發酵罐，采用邊發酵邊分離提取的技術應用大腸桿菌基因工程菌株產異丁醇的量已達到50g/L。

運動發酵單胞菌（Zymomonas?mobilis）ATCC?10988是一種革蘭氏陰性菌，它獨有的ED代謝途徑能夠高效地利用葡萄糖和果糖生成乙醇。運動發酵單胞菌與其他菌相比能耐受較高濃度的葡萄糖及乙醇，在乙醇濃度5.5%條件下可以不影響生長，濃度達到7.7%時無法生長；在含有20%濃度葡萄糖環境中可以正常生長，當濃度達到40%時仍有11～89%的菌株可以存在。此外，在代謝方面，運動發酵單胞菌具有很高的轉化效率，它只把很少量的一部分葡萄糖同化作為構造細胞用，約98%的葡萄糖發酵生成乙醇，只有2%作為碳源。然而，目前還沒有利用基因工程的方法研究運動發酵單胞菌產異丁醇的報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種產異丁醇的運動發酵單胞菌基因工程菌。

本發明的另一個目的在于提供該基因工程菌的構建方法。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

一種產異丁醇的運動發酵單胞菌基因工程菌，其特征在于：宿主菌為運動發酵單胞菌，轉入含氯霉素抗性的重組質粒pZY507KA中。也就是將kivd和adhA連接到含有氯霉素抗性的質粒pZY507上，構建得到重組質粒pZY507KA,再轉入運動發酵單胞菌中，篩選具有氯霉素抗性的菌株即為目標工程菌。

本發明克隆得到乳酸乳球菌（Lactococcus?lactis）?1.2829中的2-酮異戊酸脫羧酶基因（kivd）和醇脫氫酶基因（adhA），并將其連接到含有氯霉素抗性的質粒pZY507上，構建得到重組質粒pZY507KA。將重組質粒電轉化入Z.?mobilis中，篩選具有氯霉素抗性的菌株即為目標工程菌。

本發明所述重組質粒pZY507KA中kivd為2-酮異戊酸脫羧酶基因，來源于乳酸乳球菌中，大小為1434bp，其序列為SEQ?ID?NO：1。

所述重組質粒pZY507KA中adhA為醇脫氫酶基因，來源于乳酸乳球菌中，大小為1067bp，其序列為SEQ?ID?NO：2。

所述重組質粒pZY507KA包含表達所需的啟動子，啟動子下游有一段多克隆位點，多克隆位點包含若干單一酶切位點。

本發明進一步公開了產異丁醇的基因工程菌的構建方法包含如下步驟：

（1）以GenBank中已報道的乳酸乳球菌2-酮異戊酸脫羧酶基因為依據，設計引物，引物序列為SEQ?ID?NO：3和SEQ?ID?NO：4，利用PCR得到2-酮異戊酸脫羧酶基因。

（2）以GenBank中已報道的乳酸乳球菌醇脫氫酶基因為依據，設計引物，引物序列為SEQ?ID?NO：5和SEQ?ID?NO：6，利用PCR得到醇脫氫酶基因。

（3）表達載體的構建：

1）將步驟（1）所得的kivd基因經SacI和BamHI雙酶切后與用相同內切酶酶切后的表達載體pZY507連接，鑒定正確后，獲得重組質粒pZY507K。

2）將步驟（2）所得的adhA基因經BamHI和SalI雙酶切后與用相同內切酶酶切后的重組質粒pZY507K連接，鑒定正確后，獲得重組質粒pZY507KA。

（4）轉化：重組質粒pZY507KA轉化表達宿主運動發酵單胞菌中，構建基因工程菌，鑒定正確后即為產異丁醇的運動發酵單胞菌基因工程菌。