[發明專利]微量白蛋白熒光免疫定量檢測試劑盒及其制備方法

無效

• 申請號: 201210383644.4
• 申請日: 2012-10-11
• 公開（公告）號: CN102879586A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 蘇恩本;王勇;陳偉;黃力
• 申請（專利權）人: 南京基蛋生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/533
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于醫學免疫體外診斷領域，具體涉及一種微量白蛋白熒光免疫定量檢測試劑盒及其制備方法。

背景技術

正常情況下，血漿中白蛋白通過腎小球毛細血管網時，很少進入原尿，即使少量通過，99％可被曲腎小管重新吸收，因此終尿中白蛋白不存在。但是由于腎功能衰竭、糖尿病和心血管疾病并發癥等因素可以導致白蛋白病理性升高。一般情況下，尿蛋白明顯升高，常見于嚴重腎小球病變，輕度增加表示腎小管損害。人尿液中的白蛋白達到在30-300mg/天或20-200mg/L濃度稱為微量白蛋白（又名微量尿白蛋白，Micoralbuminuria，MAU）。微量白蛋白通常被認為是腎功能衰竭、糖尿病和心血管疾病并發癥等重要臨床標志之一。因此，尿液中白蛋白存在水平的檢測對上述疾病的早期診斷、早期治療和減小風險由重要的參考價值和臨床意義。

目前，測定微量白蛋白的方法有芯片電泳法、毛細管電泳法、酶聯免疫分析法、高效液相色譜法等。在這些檢測方法較為繁瑣、歷時較長、費用較高，不利于臨床醫生的及時診斷和療效觀察。

中國專利申請號200810305085.9公開了一種半定量檢測尿微量白蛋白膠體硒試紙，該試紙條能夠檢測含量不低于20μg/ml尿液中白蛋白。此法雖然簡單，但是準確度不高、且不能定量檢測。中國專利申請號01126895.6提供了一種快速檢測腎臟損害的尿白蛋白芯片，但其未對芯片的制備工藝、檢測靈敏度、最低檢出量等重要特性給予闡述，限制了其應用的可靠性。中國專利申請號201110458518.6公開了微量尿白蛋白膠體金檢測試劑盒及其制備工藝，具體描述了該試劑盒的制備，還說明了試劑盒檢測靈敏度15μg/ml。但是膠體金免疫層析存在以下缺陷：

⑴?膠體金標記過程是靜電吸附過程，是一種物理過程，故在液相中穩定性較差，往往造成已標記上的蛋白分子又再次脫落；

⑵?只有當金顆粒集聚到一定量時，人肉眼才能觀察到紫紅色的條帶，且該顏色與背景對比度不大，從而限制了檢測靈敏度。

發明內容

本發明的目的是針對上述現有技術的缺陷，提供一種靈敏度高、操作簡便和能進行定量檢測微量白蛋白的熒光免疫定量測定試紙條及其制備方法。

本發明解決上述技術問題所采取的技術方案為：一種微量白蛋白熒光免疫定量檢測試劑盒，在底襯上依次搭接地粘貼樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙，所述的結合墊上包被有熒光膠乳微球標記的人白蛋白抗體，所述的硝酸纖維素膜上包被有白蛋白重組抗原的檢測線和兔抗鼠IgG抗體的質控線。

所述膠乳微球粒徑范圍為50nm-500nm，優選153nm。

所述熒光膠乳微球是由膠乳微球吸附熒光標記的鏈霉親和素制備得到。

所述熒光膠乳微球的熒光為直接熒光物質，優選異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明、熒光素Cy5、熒光素Cy7中的一種。

所述結合墊材質為玻璃纖維素膜或聚酯膜。

一種微量白蛋白熒光免疫定量檢測試劑盒的制備方法，包括如下步驟：

1)包被熒光膠乳微球標記人白蛋白抗體結合墊的制備：

將熒光標記的鏈霉親和素和膠乳微球吸附結合，制備得到熒光膠乳微球；

將生物素與人白蛋白單克隆抗體結合，制備得到生物素化白蛋白抗體；

將所得熒光膠乳微球和生物素化白蛋白抗體混合，即得熒光膠乳微球標記人白蛋白抗體；

將所得熒光膠乳微球標記人白蛋白抗體噴涂在結合墊上；

2)硝酸纖維素膜的制備：

用包被緩沖液分別稀釋白蛋白重組抗原和兔抗鼠IgG抗體，并將稀釋后的白蛋白重組抗原和兔抗鼠IgG抗體分別平行地噴于硝酸纖維素膜上形成白蛋白檢測線和兔抗鼠IgG抗體質控線；

3）在底襯上順次相互搭接地粘貼樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜和吸水紙得到試紙板，按照要求切割成適當寬度的試紙條。

本發明能夠準確定量檢測人尿液中微量白蛋白含量，具有操作簡便、準確度高、靈敏度高、成本低等特點。

附圖說明

圖1為本發明微量白蛋白熒光免疫定量檢測試劑盒結構示意圖。

圖2為本發明實施例1所制備的試劑盒的標準曲線。

圖3為本發明實施例1所制備的試劑盒的線性范圍相關性。

圖4為本發明實施例1所制備的試劑盒與與奧林巴斯AU5400全自動生化儀及配套英國朗道生產的微量白蛋白試劑盒檢測結果相關性比較。

其中，圖1：1、底襯；2、樣品墊；3、結合墊；4、硝酸纖維素膜；5、吸水紙；6、檢測線；7、質控線。