[發(fā)明專利]一種肌肉特異表達(dá)豬IGF1基因的過(guò)表達(dá)載體

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210383179.4
• 申請(qǐng)日: 2012-10-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102978202A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-03-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李奎;宋成義;吳晗;鞠輝明;白立景
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所;揚(yáng)州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12N15/63
• 代理公司: 南京知識(shí)律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種安全型骨骼肌特異表達(dá)豬類胰島素生長(zhǎng)因子1(insulin-like?growth?factor1,IGF1)基因的過(guò)表達(dá)載體。

背景技術(shù)

在研究基因功能及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)過(guò)程中，人們常常借助真核表達(dá)載體來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如pcDNA3.0系列載體。傳統(tǒng)方法往往通過(guò)分子生物學(xué)手段將目的基因片段連接到病毒啟動(dòng)子（如CMV啟動(dòng)子）或異源性強(qiáng)啟動(dòng)子下游，以指導(dǎo)外源基因表達(dá)。該方法在基因表達(dá)及功能的研究中有著極其廣泛的應(yīng)用，但諸多研究暴露了該手段不足的一面：異源性基因序列導(dǎo)入宿主常引起基因組序列的紊亂，內(nèi)源性基因表達(dá)異常，甚至改變宿主固有的特征表型；也常常引起人們對(duì)轉(zhuǎn)基因倫理問(wèn)題的爭(zhēng)論。此外，病毒啟動(dòng)子序列或指導(dǎo)質(zhì)粒DNA復(fù)制等原核攏余序列的引入，易引起轉(zhuǎn)基因安全問(wèn)題，須經(jīng)長(zhǎng)期的生物安全評(píng)價(jià)才能投入實(shí)際應(yīng)用，既費(fèi)時(shí)又耗費(fèi)財(cái)力。同時(shí)，普遍性過(guò)表達(dá)外源基因常引起機(jī)體生長(zhǎng)等的異常。因此，在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行動(dòng)物遺傳改造時(shí)，同一物種的內(nèi)源基因序列，以及組織表達(dá)的特異性是保證轉(zhuǎn)基因動(dòng)物安全性的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種豬內(nèi)源性骨骼肌特異sk-α-actin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)框架，以及含有該表達(dá)框架的豬骨骼肌特異過(guò)表達(dá)豬IGF1基因安全型表達(dá)載體。

本發(fā)明所述的豬內(nèi)源性骨骼肌特異sk-α-actin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)IGF1基因的表達(dá)盒，是由依次串聯(lián)的sk-α-actin啟動(dòng)子（sk-α-actin?Promoter）、豬IGF1（C1：Ea）基因、sk-α-actin?3’UTR和SV40增強(qiáng)子組成；該表達(dá)盒序列如SEQ?ID?No.1所示。

本發(fā)明所述骨骼肌特異過(guò)表達(dá)豬IGF1基因安全型表達(dá)載體，含有上述的豬內(nèi)源性骨骼肌特異sk-α-actin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)盒，是通過(guò)EcoRV酶切位點(diǎn)克隆到轉(zhuǎn)座子載體pT2-HB中而獲得；該表達(dá)載體的序列如SEQ?ID?No.2所示。

本發(fā)明中所述豬內(nèi)源性骨骼肌特異sk-α-actin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)IGF1基因的表達(dá)盒是由依次串聯(lián)的sk-α-actin啟動(dòng)子、豬IGF1（C1：Ea）基因、sk-α-actin?3’UTR和SV40增強(qiáng)子組成；所述豬內(nèi)源sk-α-actin啟動(dòng)子為克隆測(cè)序的2602個(gè)核苷酸序列；所述sk-α-actin?3’UTR為克隆測(cè)序的751個(gè)核苷酸序列；所述豬IGF1（C1：Ea）基因CDS全長(zhǎng)為393個(gè)核苷酸序列，具有GENBANK號(hào)為NM?214256.1的自5′端第13－405位核苷酸序列;所述SV40增強(qiáng)子為242個(gè)核苷酸序列，從pGL3-control載體自+1第2201-2442位核苷酸序列克隆獲得。

所述表達(dá)載體安全性體現(xiàn)在載體表達(dá)調(diào)控元件及目的基因均克隆自豬內(nèi)源序列，以及轉(zhuǎn)座子載體序列為脊椎動(dòng)物所特有，表達(dá)載體的核苷酸序列見(jiàn)序列表。

本發(fā)明中的骨骼肌特異過(guò)表達(dá)豬IGF1(C1：Ea)基因的安全型表達(dá)載體，在細(xì)胞水平上驗(yàn)證了骨骼肌特異sk-α-actin啟動(dòng)子在成肌細(xì)胞中能高效表達(dá)，在具有成肌分化潛能的PEF細(xì)胞中僅低水平表達(dá)而在其他類型細(xì)胞中不表達(dá)；本發(fā)明中構(gòu)建的載體制備轉(zhuǎn)基因小鼠，通過(guò)定量PCR和Western?Blot檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌中IGF1基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平分別為野生型小鼠的15倍和3.5倍，并且僅在骨骼肌中高效表達(dá)，為制備安全、骨骼肌特異表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因豬模型提供了平臺(tái)。

附圖說(shuō)明

圖1：PCR擴(kuò)增sk-α-actin?Promoter產(chǎn)物電泳圖；

圖2：PCR擴(kuò)增sk-α-actin?3’UTR產(chǎn)物電泳圖；

圖3：PCR擴(kuò)增豬IGF1(C1：Ea)cDNA產(chǎn)物電泳圖；

圖4：PCR擴(kuò)增SV40Enhancer產(chǎn)物電泳圖；

圖5：表達(dá)載體元件連接示意圖；

圖6：pT2/α-actin-IGF1質(zhì)粒酶切產(chǎn)物電泳圖；

圖7：pT2/α-actin-IGF1質(zhì)粒圖譜；

圖8：pT2/α-actin-△_IGF1骨架驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因GFP在各組細(xì)胞中表達(dá)；

圖9：pIGF1轉(zhuǎn)基因鼠PCR檢測(cè)外源基因；

圖10：pIGF1轉(zhuǎn)基因鼠SOUTHERN?BLOT檢測(cè)外源基因；

圖11：熒光定量檢測(cè)IGF1基因在轉(zhuǎn)基因小鼠組織器官中的表達(dá)；