[發明專利]一種新型人胎盤屏障體外模型

有效

• 申請號: 201210383101.2
• 申請日: 2012-10-11
• 公開（公告）號: CN102899284A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發明（設計）人: 宋殿榮;郭潔;韓芳;張崴;王雅楠;王玉華
• 申請（專利權）人: 天津中醫藥大學第二附屬醫院
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073
• 代理公司: 天津市鼎和專利商標代理有限公司 12101
• 代理人: 崔繼民

1.一種新型人胎盤屏障體外模型，其特征在于通過如下方法建立，包括步驟：

1)制備胎盤組織薄片

●收集胎盤：選擇25-30歲，孕36-40周足月分娩的健康產婦胎盤，胎盤娩出后，在無菌條件下，用冰冷的含肝素的生理鹽水充分沖洗胎盤，之后浸于冰冷的含肝素的KRBB中；

●用冰冷的含肝素的生理鹽水充分沖洗胎盤，之后浸于冰冷的含肝素的KRBB中備用；

●切取胎盤組織塊：在胎盤終末絨毛部位，取2塊組織塊，用KRBB漂洗；

●玻璃化冷凍法冷凍胎盤組織：在室溫下將組織塊移至冷凍保護液A中平衡5min，然后移入冷凍保護液B中快速清洗至少10次，時間控制在50s內；之后迅速將組織塊移至冷凍的葉片上，將載有組織塊的冷凍葉片立即投入液氮中保存30s；

●振動切片：按照Leica?VT1000振動切片機的說明設置速度、頻率、切片厚度，將冷凍好的胎盤組織塊用專用膠水固定在切片機的托盤中進行切片；

●組織復蘇：將切好的胎盤組織薄片按照母體面-胎兒面的方向固定于擴散池的夾片上，迅速浸入37℃含1.0mol/L的蔗糖液中1min，然后順次移至含0.5mol/L、0.25mol/L的蔗糖液中，分別停留3min，最后在純水中平衡5min；

2）建立人胎盤屏障體外系統

將恒溫水浴槽經樹脂膠管與溫度加熱塊相連，調節恒溫浴槽內水溫維持Ussing擴散池內溫度保持37℃恒溫；將Ussing擴散池的通氣針閥與氣體供應裝置連接，同時Ussing擴散池的兩側通入95％O₂和5％CO₂的混合氣體；調節氣體供應裝置和擴散池的通氣針閥控制通氣流，以保證氣泡緩慢均勻地從池底鼓出；

3）將胎盤組織薄片固定連接在擴散池中

●樣品固定：將復蘇后的胎盤組織薄片固定于樣品夾片上，將載有胎盤組織的樣品夾片插入擴散池兩室底部的插口內，固定完好；

●加注灌流液：樣品固定后即刻在擴散池的母體側和胎兒側同時緩慢加入預熱至37.5℃，pH7.4的培養液KRBB?7mL；

●調節氣流：調節氣體供應裝置和擴散池的通氣針閥控制通氣流，保證氣泡緩慢均勻地從池底鼓出；

●平衡：37.5℃恒溫條件下維持胎盤組織薄片的活性，轉運實驗開始前將組織薄片預平衡30min；

所述冷凍保護液A是將7.5%乙二醇、7.5%DMSO、85%純水充分混合后配制的溶液；冷凍保護液B是將15%乙二醇、15%DMSO、70%純水充分混合后配制的溶液。