[發明專利]一株基因改性的高效解磷工程菌及其應用

有效

• 申請號: 201210382821.7
• 申請日: 2012-10-10
• 公開（公告）號: CN102876624A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 孫立文;許仁杰;李慶財;趙學民
• 申請（專利權）人: 山東禹城瑞利源科技有限公司;北京中農瑞利源高科技發展有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/75;C05G3/00;C12R1/07
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司 11322
• 代理人: 魯兵

1.一株基因改性的高效解磷工程菌，為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens）PS57H?1CGMCC?No.6089。

2.根據權利要求1所述的高效解磷工程菌，其特征在于：所述解淀粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens）PS57H1CGMCC?No.6089是革蘭氏陽性桿菌，頂端生芽孢；在YPD培養基上生長良好，48h形成直徑2-3mm大小的圓形菌落，有運動性，好氧，菌落呈白色有光澤，表面濕潤、平坦，邊緣整齊；生長溫度范圍：25℃-37℃，最適生長溫度：30℃-37℃；生長酸堿度范圍：pH?2-9，最適pH值為7.0。

3.一種高效解磷微生物菌劑，其活性成分為權利要求1或2所述的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens）PS57H1?CGMCC?No.6089的發酵液或發酵液干燥得到的固體菌劑。

4.根據權利要求5所述高效解磷微生物菌劑，其特征在于，為所述發酵液與草炭、輕質碳酸鈣經混合、粉碎得到的，三者混合比例為1:3-5:0.03-0.05，優選1:4:0.04（重量比）。

5.一種構建權利要求1或2或3或4所述解淀粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens）PS57H1?CGMCC?No.6089的方法，包括以下步驟：

1）選定一株能解磷的芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens）PS57，其16S?rDNA序列如序列表中序列1所示；

2）在序列表中序列2所示的葡萄糖脫氫酶基因(gdh)的5’端添加枯草桿菌蛋白酶E基因啟動子（PsubE），在3’端添加枯草桿菌蛋白酶E基因轉錄終止子（TsubE），得到序列表中序列3所示的葡萄糖脫氫酶基因的完整表達元件，然后將其克隆到芽孢桿菌-大腸桿菌穿梭質粒pHY300PLK的BamH?I和Sal?I酶切位點之間，得到攜帶葡萄糖脫氫酶基因完整表達元件的芽孢桿菌表達載體pHYH；

3）將攜帶葡萄糖脫氫酶基因完整表達元件的芽孢桿菌表達載體pHYH通過電擊轉化方法導入芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefacien3）PS57中，得到基因改造的高效解磷工程菌即解淀粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens）PS57H1?CGMCC?No.6089。

6.一種得到權利要求3或4所述解淀粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens）PS57?CGMCC?No.6089的發酵液的方法，包括以下步驟：

1）配制無機磷細菌液體培養基，配方為：葡萄糖10g，硫酸銨0.5g，酵母粉0.5g，氯化鈉0.3g，氯化鉀0.3g，硫酸鎂0.3g，硫酸亞鐵0.03g，硫酸錳0.03g，磷酸鈣5g，蒸餾水1000mL，pH?7.0-7.5，將培養基在使用前用常規方法115℃滅菌30min；

2）將解淀粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens）PS57H1?CGMCC?No.6089按5％的比例接種于步驟1）的無機磷細菌液體培養基中，在搖瓶轉速180-200r/min下培養20-24h，得到PS57H1發酵液。

7.一種制備權利要求4所述高效解磷微生物菌劑的方法，將權利要求6所述PS57H1發酵液與高溫滅菌后的草炭、輕質碳酸鈣按照1:4:0.04（重量比）的比例在攪拌機內攪拌均勻，粉碎后得到。

8.一種活化磷肥，其特征在于，包括磷肥和按磷肥質量的1-50％添加的權利要求3或4所述高效解磷微生物菌劑。

9.解淀粉芽孢桿菌（Bacillus?amyloliquefaciens）PS57H1?CGMCC?No.6089在溶解土壤難溶磷中的應用。

10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于：所述土壤難溶磷為包括磷酸鈣、磷灰石和磷鐵礦中的磷酸三鈣等的無機磷。