[發明專利]鐵皮石斛人工種子的制作和貯藏方法

有效

• 申請號: 201210382702.1
• 申請日: 2012-09-20
• 公開（公告）號: CN102893865A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發明（設計）人: 賴佳;李煥秀;許軻;唐懿;秦耀國;羅倩;朱永鵬;鄭陽霞
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00;A01F25/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種鐵皮石斛人工種子的制作和貯藏方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)原球莖的誘導：

將鐵皮石斛成熟但尚未開裂的蒴果在自來水下沖洗1-2h，放入超凈工作臺中，先用75％酒精浸泡0.5-1min，無菌水沖洗3-5次，再用0.1％氯化汞溶液浸泡8-10min，無菌水沖洗3-5次，置于無菌濾紙上吸干表面水分，用解剖刀將蒴果切開，將蒴果內種子均勻撒播在原球莖誘導培養基上，置于25℃人工氣候箱中，先進行5d黑暗培養，然后轉入光照培養，光照強度為2000lx，每日光照時間為16h，培養15d后種子萌發形成綠色的原球莖；原球莖誘導培養基組成為MS+0.5mg/L萘乙酸+30g/L蔗糖+10％上豆汁+0.5％活性炭+0.7％瓊脂，pH?5.8，培養基預先在121℃下高壓滅菌15-20min，

(2)原球莖的液體懸浮培養增殖

將誘導獲得的鐵皮石斛原球莖接種于液體增殖培養基中進行懸浮培養，每瓶裝培養基25-30ml，接種原球莖重量為1.5-2.0g，將培養瓶置于25℃恒溫搖床上振蕩培養，轉速為80-100r/min，光照為自然漫射光，每培養15d更換一次培養液；

原球莖液體增殖培養基配方為1/2MS+0.5mg/L萘乙酸+2.0mg/L?6-芐氨基嘌呤+30g/L蔗糖+0.1-0.5g/L聚乙烯吡咯烷酮，pH?5.8，其中1/2MS為大量元素減半的MS基本培養基：

(3)人工種子的制作

以MS+0.5mg/L萘乙酸+2.5mg/L?6-芐氨基嘌呤+30g/L蔗糖+0.3-0.4wt％多菌靈+0.2wt％活性炭+20mg/L脫落酸為人工胚乳，在其中加入3-4wt％海藻酸鈉熬制成半凝膠，經121℃高壓滅菌20min后冷卻備用，在超凈工作臺上，將經過30d液體懸浮增殖培養的大小為2-4mm的鐵皮石斛原球莖均勻懸浮于半凝膠中，用內直徑為4mm的滴管吸取半凝膠和原球莖滴入已滅菌冷卻的50-150mmol/L硝酸鈣溶液中，保證每滴半凝膠中只含有一顆原球莖，經過20-30min離子交換反應，倒去硝酸鈣溶液，用無菌水漂洗3次即可得到人工種子；

(4)人工種子的貯藏

在超凈工作臺上，將制得的人工種子置于無菌濾紙上吸干表面水分，再將其放入已滅菌烘干的三角瓶中，用封口膜密封好后，放置在4℃冰箱中黑暗保存。