[發明專利]一種近紅外生物熒光染料在活細胞成像中的應用

有效

• 申請號: 201210382198.5
• 申請日: 2012-10-10
• 公開（公告）號: CN103725758A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 汪鵬飛;周炳江;劉衛敏;陳建宏;莊曉青
• 申請（專利權）人: 中國科學院理化技術研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司 11257
• 代理人: 張文祎

技術領域

本發明涉及活細胞與成像，提供一種近紅外生物熒光染料在活細胞成像中的應用。

背景技術

隨著生命科學研究的快速發展，生物熒光染料在細胞免疫學、分子生物學、分子遺傳學等方面應用越來越廣泛，已經成為生命科學研究的重要工具之一。

RNA普遍存在于動物、植物、微生物及某些病毒和噬菌體內，RNA和蛋白質生物合成有密切的關系。在RNA病毒和噬菌體內，RNA是遺傳信息的載體。常用的RNA成像方法有;帶有熒光標記的RNA微注射，RNA原位熒光雜交，通過綠色熒光蛋白（GFP）或其衍生物YFP標記與RNA結合的蛋白或是有機染料小分子對RNA進行染色成像。目前商用的用于RNA染色的染料只有SYTO?RNASelect一種，且其結構尚未公布。有機小分子熒光染料具有分子體積小，細胞通透性好，光穩定性好等特點。用于DNA染色的有機染料報道很多，但是RNA的卻很少，這是由于有機染料對DNA雙鏈結構的選擇性要高于RNA的單鏈結構，所以RNA選擇性染料的開發具有重要的應用價值。

線粒體是有氧呼吸產生能量的主要場所，能將細胞中的一些有機物當燃料，使這些與氧結合，經過復雜的過程，轉變為二氧化碳和水，同時將有機物中的化學能釋放出來，供細胞利用。由于線粒體的作用，生物組織內有機物能在氧的參與下轉變成無機物，如二氧化碳和水，并為生物組織和細胞提供進行生命活動所需的能量或ATP。目前線粒體的熒光探針主要有：Mitotracker系列，JC-1,Rhodanmine?123,Rhodanmine?6G,DiOC7(3),Acridne?orange-10nonyl?bromide,DASPMI和DASPEI。

活細胞成像技術的發展有助于我們實時地研究細胞的生命活動，獲取更具價值的細胞信息。用于活細胞成像的生物熒光染料很多，但是大部分這些熒光染料的吸收和發射都在400nm-600nm，發射在近紅外區域（650nm~900nm）的染料很少。現有的染料在進行染色時，受背景熒光的干擾大。因此，需要對染料和染色過程進行改進，以便減弱背景熒光的干擾，使染色更徹底。

發明內容

本發明要解決的技術問題是現有熒光染料在進行染色時，受背景熒光的干擾大，染色不徹底等。本發明通過細胞培養、配制染料溶液、染色步驟，用近紅外生物熒光染料將活細胞成像；本發明染色可以減少光源對細胞及組織的損傷，降低自發熒光的干擾，染色更徹底；本發明使用的一些近紅外熒光染料對線粒體或者RNA染色具有特異性。

本發明提供一種近紅外生物熒光染料在活細胞成像的應用，應用方法包括以下步驟：

1）細胞培養

將細胞接種于共聚焦皿中，在37℃、5%CO₂、飽和濕度的細胞培養箱中培養12~24h；其中，細胞培養液中含相應的培養基、10%體積百分數的胎牛血清、100μg/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素；

2）染料溶液的配制

將近紅外生物熒光染料用二甲亞砜（DMSO）配成5mM~10mM的染料溶液；

3）染色

直接向原細胞培養液中加入步驟2）得到的染料溶液，搖勻，使近紅外生物熒光染料的最終濃度為500nM~5μM，得到原細胞培養液和染料溶液的混合液，在37℃、5%CO₂、飽和濕度中孵育細胞10分鐘以上，將線粒體或RNA染色；

4）成像

移去步驟3）的混合液，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS緩沖溶液）沖洗細胞2次以上，之后加入新鮮的細胞培養液，在活細胞工作站中保持37℃、5%CO₂、飽和濕度，用激光共聚焦顯微鏡進行拍攝成像，激發波長為640nm；

其中，所述近紅外生物熒光染料具有式（I）結構：