[發明專利]高特異高敏感檢測腸產毒性大腸桿菌STa基因的方法

無效

• 申請號: 201210380630.7
• 申請日: 2012-10-10
• 公開（公告）號: CN103725754A
• 公開（公告）日: 2014-04-16
• 發明（設計）人: 金京勛;沈強;呂少波
• 申請（專利權）人: 蘇州四同醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 曹毅

技術領域

?本發明涉及疾病檢測技術領域，具體的說，是一種高特異高敏感檢測腸產毒性大腸桿菌STa基因的方法。

背景技術

腸產毒性大腸桿菌(ETEC)性腸炎主要通過污染的水源、食品、牛奶、飲料等傳播，產毒性大腸桿菌(ETEC)產生的毒素分為不耐熱腸毒素(LT)和耐熱腸毒素(ST)，根據其來源不同，耐熱腸毒素又可分為豬源性(STp)和人源性(STa)，它們分別由位于質粒上的三種毒力基因編碼，產毒性大腸桿菌(ETEC)一般含有三個毒力基因中的一個或幾個基因。腸產毒性大腸桿菌（ETEC）檢測以LT檢測為主，但是約有5~10%腸產毒性大腸桿菌不具有LT基因，容易漏檢，本發明提供高特異性檢測STa基因的引物序列和方法，以提高腸產毒性大腸桿菌的檢測率。

環介導等溫擴增技術是由日本榮研（EIKEN）株式會社開發的高特異性敏感度的核酸檢測系統，無須昂貴的設備，已經成為核酸快速檢測法的良好手段，本發明結合環介導等溫擴增技術，設計針對大腸桿菌O157特異性基因序列的一對外引物（ETEC-F3和ETEC-B3）和一對內引物（ETEC-FIP和ETEC-BIP）進行環介導等溫擴增。

發明內容

本發明公開了一種高特異高敏感檢測腸產毒性大腸桿菌STa基因的方法，提高了腸產毒性大腸桿菌的檢測和診斷效率。

為實現上述技術目的，達到上述技術效果，本發明通過以下技術方案實現：

高特異高敏感檢測腸產毒性大腸桿菌STa基因的方法，包括以下步驟：

步驟1）制備反應液

反應液組成及含量為

8u/ul?Bst核酸聚合酶?????????????????????????8u

10X耐熱聚合酶反應緩沖液?????????????????1X，MgSO4?2mM

4M?甜菜堿????????????????????????????????????1M

10mM?d-NTP混合液???????????????????????????400μM

內引物

???ETEC-FIP??????????????????????????????????40umol

???ETEC-BIP??????????????????????????????????40umol

外引物

????ETEC-F3???????????????????????????????????5umol

????ETEC-B3???????????????????????????????????5umol

標本核酸???????????????????????????????????????20ng

添加焦碳酸二乙酯處理水至總量達到25ul；

步驟2）將上述反應液放入63℃烘箱進行反應30-60min，渾濁為陽性;

步驟3）使用大腸桿菌ETEC-STa+菌株，核酸STp+菌株，以及臨床分離金黃色葡萄球菌以及若干臨床分離頭皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯菌的核酸，進行反應，觀察它們的陰陽性。

進一步的，所述外引物ETEC-F3的序列為TTTGTCATGCAGCCCATC。

進一步的，所述外引物ETEC-B3的序列為TAGGTAGGTAGGTAGGTAGG。??

進一步的，所述內引物ETEC-FIP的序列為

CGACTGGATGACGTGATAAGTG-CTACATCTCACCTTTTTTAGACC。

進一步的，所述內引物ETEC-BIP的序列為TCAAAGGCTTTAAGACGTAGACTTT-GGTAGGTAACAACTCTCATTG。

進一步的，所述反應液中加入熒光顯示物質溴化乙錠、鈣黃綠素進行實時檢查。

本發明的有益效果是：

????本發明通過配制反應液，設計引物序列，能快速、準確的檢測腸產毒性大腸桿菌，并及時采取相應的措施，減少了疾病的發生率。

具體實施方式

下面將結合實施例，來詳細說明本發明。

?高特異高敏感檢測腸產毒性大腸桿菌STa基因的方法，包括以下步驟：

步驟1）制備反應液

反應液組成及含量為

8u/ul?Bst核酸聚合酶?????????????????????????8u