[發明專利]用于親和分離的微泡

無效

• 申請號: 201210378402.6
• 申請日: 2005-11-03
• 公開（公告）號: CN103091485A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: T·亞當斯;E·雅布隆斯基
• 申請（專利權）人: 艾瑞斯國際有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/552
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 郭輝

本申請是國際申請號為PCT/US2005/040162，國際申請日為2005年11月3日的PCT國際申請進入中國國家階段后的申請，申請號為200580038082.8，發明名稱為“用于親和分離的微泡”的發明專利申請的分案申請。

技術領域

本發明涉及用于親和分離、親和純化和親和分析的基于親和分子包衣微泡的方法、組合物及試劑盒。

背景技術

細胞、病毒、細菌和水溶性分子的分離領域已使用了各種微粒作為固相來吸附或結合所關注的目標物質。例如，配體(如抗體)包衣的磁性微粒可以結合到靶細胞或水溶性蛋白質上。目標物質通過結合到磁性微粒上，實現了其與他類細胞或蛋白質的分離。目前對該原創性工作已有各種改進，且多年前就出現有商業化產品。

其他研究者曾經使用過橡膠顆粒、脂質體、乳脂球和塑料顆粒(如聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、尼龍等)。作為捕獲載體，這些物質都具有其各自的特性和問題。對非目標細胞或蛋白質的非特異性吸附是這些方法中最常見的問題，從而導致分離不良。此外，大多數方法在結合步驟以后都需要至少一個附加步驟以實現未結合樣品和微粒結合物之間的分離，如磁性微粒需要施加磁場；有時需要通過離心或過濾將微粒從溶液中分離。

微粒結合目標細胞或蛋白質所需的時間通常與其表面積和單位體積溶液中的微粒數相關。顆粒越小，表面積越大，從而結合越快。然而，大的表面積通常會增加非特異性結合。

分離方法可能會根據其本身的性質或原理共同分離不同的微粒。這在基于重力離心法(gravity?centrifugation)的分離中尤為明顯，在此過程中微粒、細胞或其它物質可能會共同形成丸狀(co-pellet)。此外，某些細胞類型如巨噬細胞和單核細胞，它們本身可以非特異性吞噬這些微粒，從而和目標細胞一起被分離。盡管通過一定的步驟或預防措施可以將以往技術中的個別問題最小化或避免，但某些局限性是內在的且是不可能徹底克服的。目前不同的方法獲得了不同程度的成功，這表明需要尋找一個更好的解決該問題的辦法。

最理想的分離制劑應該具有無窮大的表面積而完全沒有非特異性相互作用，從而保證結合過程可以快速進行，并將其與非目標細胞或水溶性分子的結合降至最低。理想的分離劑應當在不捕獲非目標細胞或分子的前提下達到其和細胞懸液或可溶性分子溶液間的分離。

發明內容

本發明提供了用于親和分離或親和分析的組合物，其包括親和分子共價包衣的微泡。本發明的一個實施方式中，所述微泡為蛋白質微泡，如白蛋白微泡。通過向蛋白質溶液中引入氣體，如采用超聲處理，可以制得蛋白質微泡。作為本發明的一個方面，通過包括加熱蛋白質溶液的方法可以向其中引入氣體。在另一實施方式中，通過蛋白質變性或以Cr⁺⁺⁺處理，可以穩定蛋白質微泡。

本發明的另一實施方式中，所述微泡為玻璃微泡。作為本發明的一個方面，所述玻璃微泡的密度約為0.6g/cc，平均直徑為30μm左右。

本發明中的親和分子可以是受體、配體或抗體。或者，該親和分子也可以是生物素、抗生物素蛋白或鏈親和素。

可通過例如使用異雙功能試劑，如4-(N-馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亞胺酯，將親和分子直接連接到微泡上。在本發明另一實施方式中，親和分子通過例如和至少另一個分子相互作用，間接連接到微泡上。作為本發明的一方面，微泡直接連接到鏈親和素上，而親和分子是生物素化的，通過鏈親和素和生物素的相互作用將親和分子連接到微泡上。

在本發明的一個實施方式中，親和分子可以通過微泡上的環氧包衣連接到微泡上。在另一實施方式中，親和分子通過微泡上的胺基官能團連接到微泡上。

作為本發明的一方面，玻璃微泡經處理產生具有反應活性的表面殘基，該殘基和3-氨丙基三乙氧基硅烷反應，產生胺。另一方面，玻璃微泡具有順式-二醇包衣，通過該順式-二醇(cis-diol)包衣，親和分子可以直接連接到玻璃上。可例如如下產生順式-二醇包衣：處理玻璃微泡以產生具有反應活性的表面羥基殘基，使該殘基與3-環氧丙氧基三甲氧基硅烷反應產生環氧官能團，用酸處理該環氧官能團，使該環氧官能團轉化為順式-二醇官能團。

本發明也提供了一種產生用于親和分離或親和分析的蛋白質微泡的方法。一方面，該方法包括加熱蛋白質溶液。在該方法的另一方面，通過超聲處理蛋白質溶液，向其中引入氣體，從而制得蛋白質微泡。在該方法的另一方面，在一種氣體或混合氣體的存在下對蛋白質溶液進行機械處理。

作為本發明的另一個方面，所述氣體為空氣，所述蛋白質為白蛋白。通過例如Cr⁺⁺⁺處理可以穩定蛋白質微泡。