[發明專利]一種可識別HCV NS5A蛋白的核酸適體、核酸適體的衍生物及其篩選方法和應用

有效

• 申請號: 201210377235.3
• 申請日: 2011-06-03
• 公開（公告）號: CN102864150A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發明（設計）人: 朱海珍;方曉紅;劉斌;楊大榮;徐麗;雷少華;劉念禮
• 申請（專利權）人: 湖南大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;C12N15/10;C12Q1/70;C12Q1/68;A61K48/00;A61P31/14
• 代理公司: 湖南兆弘專利事務所 43008
• 代理人: 趙洪;楊斌

1.一種可識別HCV?NS5A蛋白的核酸適體，其為SEQ?ID?NO：5序列所示的DNA片段。

2.一種如權利要求1所述核酸適體的衍生物，該衍生物為以下a～d中的任意一種：

a）將所述核酸適體進行核苷酸取代后得到的RNA核酸適體；

b）將所述核酸適體骨架改造為硫代磷酸酯骨架后得到的核酸適體衍生物；

c）將所述核酸適體改造為肽核酸后得到的核酸適體衍生物；

d）將所述核酸適體連接上放射性分子后得到的核酸適體衍生物。

3.一種如權利要求1所述的核酸適體的篩選方法，包括以下步驟：

（1）制備丙型肝炎病毒NS5A蛋白：以pJFH1質粒作為PCR擴增的模板，用第一引物對NS5A基因進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；用限制性酶NdeⅠ和HindⅢ雙酶切所述的PCR擴增產物，獲得酶切產物；用限制性酶NdeⅠ和HindⅢ雙酶切原核表達載體pET28b，回收載體骨架；將所述酶切產物和載體骨架連接，得到連接產物；將該連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，用含卡那霉素的LB平板篩選陽性克隆，提取得到重組質粒pET28b-NS5A；再經過大量表達及純化過程，制得帶組氨酸標簽的丙型肝炎病毒NS5A蛋白；

（2）制備對照蛋白LacZ：用pET200/D/LacZ蛋白的編碼基因與載體上的組氨酸標簽的編碼基因融合，表達帶組氨酸標簽的pET200/D/LacZ蛋白；再經過大量表達及純化過程，制得帶組氨酸標簽的pET200/D/LacZ蛋白；

（3）蛋白的固定：取Ni-NTA瓊脂糖微珠，經預處理后分別分散于步驟（1）制得的帶組氨酸標簽的丙型肝炎病毒NS5A蛋白和步驟（2）制得的帶組氨酸標簽的pET200/D/LacZ蛋白中，經孵育、洗滌后分別得到固定有靶標蛋白的微珠和固定有對照蛋白的微珠；

（4）隨機核酸文庫的設計：設計兩端包含20個核苷酸、中間包括40個核苷酸的隨機核酸文庫如下：5’-ACGCTCGGATGCCACTACAG（N40）CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’；其中，N40表示40個隨機核苷酸；

（5）核酸適體的篩選：

A）DNA文庫預處理：將步驟（4）設計的隨機核酸文庫溶于結合緩沖液中；

B）反篩：將步驟（3）制得的固定有對照蛋白的微珠與所述預處理后的隨機核酸文庫混合，孵育、洗滌后再進行超濾離心；

C）正篩：將上述超濾離心后的溶液與步驟（3）制得的固定有靶標蛋白的微珠混合，經過孵育、洗滌后轉移微珠，再將轉移后的微珠進行加熱、冷卻和離心，收集上清，以上清液中的DNA為模板并利用生物素標記的第二引物對進行PCR擴增，擴增后通過親和素包被的葡聚糖珠分離生物素標記的PCR擴增產物，然后使雙鏈DNA變性解鏈，收集生物素標記的DNA單鏈，脫鹽后用于下一輪篩選；

D）反復篩選：重復上述步驟B~步驟C，在重復篩選過程中逐步增加篩選壓力，經過多輪反復篩選后，以篩選產物為模板通過第三引物對進行PCR擴增，獲得競爭能力強、序列長度得到優化的核酸適體。

4.根據權利要求3所述的核酸適體的篩選方法，其特征在于：

所述步驟（1）中選用的第一引物對是指以下序列的引物對：

5’-?CGCGCCATATGTCCGGATCCTGGCTCCGCGAC?-3’??和

5’-?CTGCAGAAGCTTTCAGCAGCACACGGTGGTATCG?-3’；

所述步驟（5）中選用的第二引物對是指以下序列的引物對：

FITC-5’-?ACGCTCGGATGCCACTACAG?-3’和

Biotin-5’-?GTCACCAGCACGTCCATGAG?-?3’；

所述步驟（5）中選用的第三引物對是指以下序列的引物對：

5’-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3’?和5’-?GTCACCAGCACGTCCATGAG-3’。