[發(fā)明專利]一種云芝糖肽中單糖組分的檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210376907.9
• 申請(qǐng)日: 2012-09-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103018352A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-04-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁萍;茅仁剛;葉曉平;陳浙江;林東昊;金丹鳳;呂丹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海師范大學(xué);上海新康制藥廠
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31227
• 代理人: 吳瑾瑜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于多糖組分分析領(lǐng)域，具體涉及一種云芝糖肽中單糖組分的檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

云芝糖肽是從擔(dān)子菌綱云芝Cov-1菌株的液體發(fā)酵菌絲體中提取得到的一種中成藥，其活性成分為結(jié)合蛋白多糖，臨床研究證明云芝糖肽具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、降血脂、促進(jìn)受損肝細(xì)胞恢復(fù)等作用，用于食管癌、胃癌及原發(fā)性肺癌患者放、化療所致的氣陰兩虛、心脾不足證。云芝糖肽是一類天然高分子有機(jī)物，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣。云芝糖肽國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)WS3-228（Z-047）-2003（Z）中記載了多糖含量測(cè)定、蛋白含量測(cè)定等主要質(zhì)控指標(biāo)。其中，多糖含量測(cè)定是采用分光光度法，以葡萄糖(C₆H₁₂O₆)作為多糖含量的測(cè)定指標(biāo)，不得少于38.0％。可見(jiàn)，我們目前缺乏監(jiān)控云芝糖肽中多糖組分的專屬性方法。

如今，市場(chǎng)上來(lái)源于云芝的產(chǎn)品較多，不僅有以云芝Cov-1菌株的菌絲體為原料制備而成的云芝糖肽，還有以其他云芝菌株菌絲體為原料的云芝胞內(nèi)糖肽以及以云芝子實(shí)體為原料制備而成的云芝多糖。由于原料不同以及提取工藝的差異導(dǎo)致不同產(chǎn)品質(zhì)量的巨大差異，臨床療效也各不相同，如云芝糖肽的適應(yīng)癥是腫瘤，云芝胞內(nèi)糖肽和云芝多糖的適應(yīng)癥主要是肝炎。然而由于現(xiàn)有云芝糖肽質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中檢測(cè)方法缺乏專屬性，尚不能有效區(qū)分采用不同原料和不同工藝制備而成的多糖肽類產(chǎn)品。

目前單糖組分色譜分離測(cè)定的方法有氣相色譜法、薄層色譜法和高效液相色譜法。但是各種色譜方法均存在一定的不足之處。氣相色譜法是測(cè)定單糖組分的經(jīng)典方法，由于糖本身沒(méi)有足夠的揮發(fā)性，所以必須在色譜分析之前預(yù)先進(jìn)行乙酰化或硅烷化衍生化處理，將糖轉(zhuǎn)化成揮發(fā)性強(qiáng)的衍生物。從而導(dǎo)致單糖組分在衍生化過(guò)程中發(fā)生異構(gòu)化，產(chǎn)生的異構(gòu)化衍生物影響了組分的分離及定量。薄層色譜法雖然比較簡(jiǎn)單，但是由于存在靈敏度低的缺點(diǎn)，有些含量低的單糖不易檢測(cè)出來(lái)。采用HPLC檢測(cè)單糖的難點(diǎn)也在于單糖不具有紫外吸收的基團(tuán)，因此必須先對(duì)單糖進(jìn)行衍生化處理，使它帶上能紫外吸收的基團(tuán)，才能進(jìn)行分析。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生化高效液相色譜法，曾被嘗試用于云芝糖肽中單糖組分的分析，雖然采用了非常復(fù)雜的梯度洗脫法也未能實(shí)現(xiàn)D-木糖、D-半乳糖和D-阿拉伯糖三種單糖的有效分離。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種云芝糖肽中單糖組分的檢測(cè)方法，從云芝糖肽中有效分離出8種單糖組分，得出該8種單糖間的摩爾比。

本發(fā)明所采用的檢測(cè)方法為1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生化高效液相色譜法，通過(guò)如下步驟實(shí)現(xiàn)：

（1）HPLC色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)；

（2）單糖組分測(cè)定，分別吸取混合對(duì)照品溶液和供試品溶液注入高效液相色譜儀中分析得到色譜圖，并根據(jù)各單糖分子量及其衍生物的色譜峰面積計(jì)算各單糖的摩爾比；所述對(duì)照品溶液為D-葡萄糖、D-甘露糖、D-木糖、L-巖藻糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、D-鹽酸氨基葡萄糖和L-鼠李糖對(duì)照品的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的衍生物溶液；所述供試品溶液為云芝糖肽酸水解產(chǎn)物的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的衍生物溶液。

所述步驟（1）中的色譜柱是以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相是乙腈-磷酸緩沖液，其中乙腈的體積百分比為16-20％，磷酸緩沖液的濃度為0.01-0.1mol/L，pH值為6.8-7.2；紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為250-260nm，理論塔板數(shù)按葡萄糖1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生物計(jì)算不得低于2000，為2000-20000。

優(yōu)選的，所述磷酸緩沖液的濃度為0.03-0.07mol/L，pH值為6.9-7.1。

所述步驟（2）中混合對(duì)照品溶液液的制備方法是，將D-葡萄糖、D-甘露糖、D-木糖、L-巖藻糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖、D-氨基葡萄糖和L-鼠李糖的對(duì)照品溶解于水；在對(duì)照品水溶液中加入NaOH溶液和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液混合并加熱，糖的總量與NaOH和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的摩爾比為1：35-40：47-55；冷卻后在混合液中加入HCl溶液中和，HCl與所述NaOH的摩爾比為1：1；烘干、萃取、取水相過(guò)濾，即得混合對(duì)照品溶液。