[發(fā)明專利]非標(biāo)記熒光PCR結(jié)合HRMA檢測(cè)副溶血弧菌的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210376792.3
• 申請(qǐng)日: 2012-09-29
• 公開（公告）號(hào): CN103184279A
• 公開（公告）日: 2013-07-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔡先全;邱德義;柏建山;鄧艷;伍朝暉;簡(jiǎn)志華;張憲臣;蔡仁杰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中山出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;G01N21/64
• 代理公司: 廣東中億律師事務(wù)所 44277
• 代理人: 魏永才

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種非標(biāo)記熒光PCR結(jié)合高分辨率熔解曲線（HRM）分析檢測(cè)副溶血弧菌的方法，屬于微生物檢測(cè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

副溶血弧菌（Bibrio?Parahemolyticus），是一種嗜鹽性細(xì)菌，系弧菌科弧菌屬，革蘭染色陰性，為多形態(tài)桿菌或稍彎曲弧菌。進(jìn)食含有該菌的食物致可食物中毒，也稱嗜鹽菌食物中毒，主要來(lái)自海產(chǎn)品。臨床上以急性起病、腹痛、嘔吐、腹瀉及水樣便為主要癥狀。副溶血性弧菌是一種海洋細(xì)菌，主要來(lái)源于魚、蝦、蟹、貝類和海藻等海產(chǎn)品。本病多在夏秋季發(fā)生于沿海地區(qū)，常造成集體發(fā)病。近年來(lái)由于海鮮空運(yùn)，內(nèi)地城市病例也漸增多。

熒光PCR檢測(cè)技術(shù)大致分為兩大類：熒光探針?lè)ǎ?biāo)記熒光PCR）和通用型的熒光染料法（非標(biāo)記熒光PCR）。前者則利用熒光標(biāo)記的特異性探針或者引物來(lái)識(shí)別模版，優(yōu)點(diǎn)是特異性更高，適用于擴(kuò)增序列專一檢測(cè)，不過(guò)檢測(cè)成本要高很多。而后者主要是利用熒光染料與雙鏈DNA分子結(jié)合發(fā)光的特性來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，其優(yōu)點(diǎn)是：無(wú)需另外設(shè)計(jì)熒光探針，簡(jiǎn)便易行，成本較低。其中，熒光染料又分為非飽和染料（如Sybr?Green）和飽和染料（如LC?Green等）。

相對(duì)Sybr?Green等非飽和染料來(lái)說(shuō)，Eva?Green、LC?Green、SYTO9等飽和染料具有以下優(yōu)點(diǎn)：①飽和的染料對(duì)PCR反應(yīng)沒(méi)有任何抑制作用，因此可以在PCR反應(yīng)之前加入，而其它非飽和熒光染料若較多加入到反應(yīng)液中會(huì)抑制PCR反應(yīng)，因此只能限量加入，從而對(duì)熒光PCR反應(yīng)的指示收到限制。②DNA高溫變性時(shí)，非飽和熒光染料加入則會(huì)造成DNA雙鏈高溫變性時(shí)，單鏈部分的熒光染料分子發(fā)生遷移，熒光染料分子重新結(jié)合到雙鏈DNA的空置位點(diǎn)，造成熒光信號(hào)沒(méi)有變化，因此出現(xiàn)假陰性，特異性下降，而飽和染料則不會(huì)出現(xiàn)此類情況。③高溫穩(wěn)定，對(duì)于高GC含量的PCR產(chǎn)物，Tm值較高，在DNA雙鏈高溫熔解時(shí)，飽和熒光染料結(jié)合核酸更穩(wěn)定。

高分辨熔解曲線分析(high-resolution?melt?analysis，HRMA)技術(shù)是近幾年來(lái)在國(guó)外興起的一種用于物種鑒定的最新遺傳學(xué)分析方法。它是一種高效穩(wěn)健的PCR技術(shù)，不受突變堿基位點(diǎn)與類型局限，無(wú)需序列特異性探針，在PCR結(jié)束后直接運(yùn)行高分辨熔解曲線分析，即可完成對(duì)物種鑒定、基因分型等的分析。因操作簡(jiǎn)便快速，使用成本低，結(jié)果準(zhǔn)確，實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作。

HRMA利用了特定的染料可以插入DNA雙鏈中的特性，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)升溫過(guò)程中雙鏈DNA熒光染料與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合情況記錄熔解曲線，從而對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。雖然帶HRM模塊的熒光PCR儀與普通熒光PCR儀購(gòu)買價(jià)格相差不大，但其溫度均一性要高很多。如普通定量PCR儀溫度均一性±0.25℃，溫度分辨率為0.1℃，而Rotor-Gene?6000溫度均一性為±0.01°C，溫度分辨率為0.02°C。其極高的溫度均一性和溫度分辨率使分辨精度可以達(dá)到對(duì)單個(gè)堿基差異的區(qū)分，加上飽和性染料（LC?Green、Eva?Green等）的出現(xiàn)，使得HRM這一技術(shù)的普及使用成為可能。

目前，副溶血弧菌的檢測(cè)方法主要有傳統(tǒng)的培養(yǎng)后分離鑒定方法和分子檢測(cè)方法。其中傳統(tǒng)的副溶血弧菌分離檢測(cè)方法，依賴于生化和形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，國(guó)際上通常以美國(guó)FDA頒布的“細(xì)菌學(xué)分析手冊(cè)”作為經(jīng)典方法。我國(guó)也參照制定頒布了副溶血弧菌檢驗(yàn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T4789.7-2008），規(guī)范了副溶血弧菌傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測(cè)方法和分子檢測(cè)方法。但傳統(tǒng)的檢測(cè)方法存在操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、易漏檢等缺點(diǎn)。分子檢測(cè)方法中，包括了常規(guī)PCR方法，但是常規(guī)PCR需要擴(kuò)增后進(jìn)行電泳，操作復(fù)雜而且極易引起污染。而探針?lè)≒CR則存在檢測(cè)成本很高，試劑保存期短等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種操作簡(jiǎn)便、快速，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，使用成本低的非標(biāo)記熒光PCR結(jié)合HRMA檢測(cè)副溶血弧菌的方法。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下方案：

一種非標(biāo)記熒光PCR結(jié)合HRMA檢測(cè)副溶血弧菌的方法，其特征在于包括以下步驟：

A、根據(jù)副溶血弧菌TLH基因設(shè)計(jì)引物對(duì)；

B、提取樣本DNA后，利用設(shè)計(jì)的引物對(duì)進(jìn)行非標(biāo)記熒光PCR擴(kuò)增；

C、應(yīng)用軟件對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增曲線和HRMA分析。

進(jìn)一步地，本發(fā)明按以下反應(yīng)步驟進(jìn)行：