[發(fā)明專利]一種重組人朊蛋白hPrP及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210374797.2
• 申請(qǐng)日: 2012-09-29
• 公開（公告）號(hào): CN102887949A
• 公開（公告）日: 2013-01-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊利峰;趙德明;楊秀進(jìn);王伊琴;宋志琦;姚皓;周向梅;尹曉敏;張爽
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/47
• 分類號(hào): C07K14/47;C07K1/16;C12N15/12;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N15/66;G01N33/68
• 代理公司: 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

1.一種重組人朊蛋白hPrP，其氨基酸序列為：

a）SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列；或

b）SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列經(jīng)替換、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基形成的具有同等功能的氨基酸序列。

2.編碼權(quán)利要求1所述重組人朊蛋白hPrP的基因，是如下a)或b)：

a）其核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?No.1所示；或

b）由SEQ?ID?No.1所示核苷酸序列經(jīng)取代一個(gè)或幾個(gè)核苷酸，得到編碼hPrP的核苷酸序列。

3.一種重組表達(dá)載體，其為含有權(quán)利要求2所述基因的表達(dá)盒。

4.如權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，其為pPROEX-htb-hPrP。

5.含有權(quán)利要求3或4所述重組表達(dá)載體的細(xì)胞系及重組菌。

6.一種構(gòu)建權(quán)利要求4所述重組表達(dá)載體的方法，包括以下步驟：1）PCR方法擴(kuò)增hPrPc基因；

2）將PCR產(chǎn)物和載體pPROEX-htb分別用內(nèi)切酶BamHI和Hind?III雙酶切；酶切產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性菌落，得到前期表達(dá)質(zhì)粒；

3）以前期表達(dá)質(zhì)粒為模板，以除去hPrPc基因前的酶切位點(diǎn)為目的設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)，將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，選取陽(yáng)性菌落提取質(zhì)粒，得到重組表達(dá)載體pPROEX-htb-hPrP。

7.如權(quán)利要求6所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟1）所述的PCR方法中所用的引物序列分別為：

上游引物：cgcGGATCCCAAGAAGCGCCCGAAGC，劃線部分為保護(hù)堿基及BamH?I酶切位點(diǎn),

下游引物：cccAAGCTTACGATCCTCTCTGGTAATAGGCC，劃線部分為保護(hù)堿基及Hind?III酶切位點(diǎn)；

50μL反應(yīng)體系為：10×Buffer?5μL，dNTP4μL，人全血基因1μL，上、下游引物各2μL，ddH₂O?35μL，高保真DNA聚合酶1μL；

PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性5min：94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2.5min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

8.如權(quán)利要求6所述的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟3）所述引物為：

P1：GAAAACCTGTATTTTCAGGGCAAGAAGCGCCCGAAGCCTGG，

P2：CAGGCTTCGGGCGCTTCTTGCCCTGAAAATACAGGTTTTC；

50μL反應(yīng)體系為：10×Buffer?5μL，dNTP4μL，前期表達(dá)質(zhì)粒1μL，P1、P2各2μL，ddH₂O?35μL，高保真DNA聚合酶1μL；

PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性5min：94℃變性40s，65℃退火30s，72℃延伸2.5min，18個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

9.一種制備權(quán)利要求1所述重組人朊蛋白hPrP的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）將權(quán)利要求3或4所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，制得人朊蛋白hPrP表達(dá)工程菌；

2）將人朊蛋白hPrP表達(dá)工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；將表達(dá)產(chǎn)物過鎳-NTA瓊脂糖樹脂層析柱，洗脫得到純化的人朊蛋白hPrP；

3）將純化的人朊蛋白hPrP復(fù)性后加入rTEV內(nèi)切酶，切除組氨酸標(biāo)簽，然后再次通過鎳-NTA瓊脂糖樹脂層析柱除去組氨酸標(biāo)簽和重組rTEV酶，將洗脫收集的液體超濾濃縮，得到重組人朊蛋白hPrP。

10.含有權(quán)利要求1所述的重組人朊蛋白hPrP的檢測(cè)試劑盒或診斷試劑。