[發明專利]穩定共表達hST3GalIV和β1-4GalT1的MDCK細胞系及構建方法和應用

無效

• 申請號: 201210374492.1
• 申請日: 2012-09-27
• 公開（公告）號: CN102839157A
• 公開（公告）日: 2012-12-26
• 發明（設計）人: 劉秀梵;孫慶;張文俊;王曉泉;胡順林
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C12N7/00;A61K39/145;A61P31/16;C12R1/93
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

1.一種穩定表達hST3GalIV和β1-4GalT1的MDCK細胞系，是MDCK-hST3GalIV-β4GalT1，其含有hST3GalIV和β1-4GalT1基因序列；所述hST3GalIV的基因序列如SEQ?ID?No:?1所示，所述β1-4GalT1的基因序列如SEQ?ID?No:?3所示；所述細胞系的保藏號是CGMCC?No.?5967。

2.權利要求1所述的穩定表達hST3GalIV和β1-4GalT1的MDCK細胞系的構建方法，其特征在于，是將帶有編碼hST3GalIV基因序列的真核表達質粒和帶有編碼β1-4GalT1基因序列的真核表達質粒轉染至MDCK細胞，最終獲得能穩定表達hST3GalIV和β1-4GalT1基因的細胞系MDCK-hST3GalIV-β4GalT1。

3.根據權利要求2所述MDCK-hST3GalIV-β4GalT1細胞系的構建方法，其特征在于包括以下具體步驟：

1）MDCK細胞的轉染及抗性細胞克隆的篩選

轉染：?MDCK細胞密度在6孔板至80%～90%密度時用于轉染；將編碼hST3GalIV基因序列的真核表達質粒和編碼β1-4GalT1基因序列的真核表達質粒各1μg質粒于100?μL無血清Opti-MEM培養基中，混勻后添加5?μL?FuGENE^?HD轉染試劑，充分混勻之后室溫孵育15分；將上述復合物覆蓋于細胞表面，補加無血清Opti-MEM培養基至總體積為2?mL，置于37℃、5%?CO₂培養箱中培養24小時后移除培養物，更換為新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養基繼續培養；

抗性細胞克隆的篩選：?轉染后36小時后用胰酶消化細胞，按1:10?的比例傳代至48孔細胞板中，繼續用含0.8?mg/mL?G418的10%胎牛血清DMEM培養基為篩選培養基培養，每孔200?μL，每3天換一次篩選培養基，G418持續篩選10-14天后，可見有抗性細胞生長；選擇生長狀態良好的抗性細胞集落，繼續用于單克隆細胞篩選：用含0.8?mg/mL?G418的篩選培養基將細胞密度稀釋至1個/100?μL，鋪于96孔細胞板中50?μL，每孔補加50?μL篩選培養基；持續篩選10天后選擇表達水平最高的克隆再次按有限稀釋法進行單克隆篩選，以確保篩選出單克隆抗性細胞；選出的細胞依次于96孔、24孔和?6孔細胞培養板中擴大培養并凍存于液氮中；

2）MDCK-hST3GalIV-β4GalT1細胞系的鑒定

提取上述所獲具有抗性細胞的RNA，并反轉錄形成cDNA，以反轉錄成的cDNA為模板，用PCR方法分別通過PCR反應擴增人源β-半乳糖苷α2,3-唾液酸轉移酶IV基因和β1-4半乳糖轉移酶1基因；擴增結果表明MDCK-hST3GalIV-β4GalT1細胞系已成功構建，

用于擴增人源β-半乳糖苷α2,3-唾液酸轉移酶IV(hST3GalIV)的引物：

3G4F：5’-?ATGGTCAGCAAGTCCCGCTGGAAG-3’

3G4R：5’-TCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3’

用于擴增人源β1-4半乳糖轉移酶1(β1-4GalT1)的引物：

B4G1F：5’-?ATGAGGCTTCGGGAGCCGCTCCTGAG-3’

B4G1R：5’-?CTAGCTCGGTGTCCCGATGTCCAC-3’。

4.權利要求1所述MDCK-hST3GalIV-β1-4GalT1細胞系用于提高禽流感病毒分離株的生長滴度以及噬斑形成能力。

5.權利要求1所述MDCK-hST3GalIV-β1-4GalT1細胞系在生產疫苗中的應用。