[發(fā)明專利]人胚肺成纖維細胞株及利用其生產(chǎn)手足口病毒疫苗的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210371784.X
• 申請日: 2012-09-29
• 公開（公告）號: CN102911910A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃鎮(zhèn);何麗芳;張翊;馬波;王麗麗;趙瓊英;張楊;武雯俊;陳敏;王馨;唐業(yè)峰
• 申請（專利權(quán)）人: 云南沃森生物技術(shù)股份有限公司
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;A61K39/295;A61K39/125;A61P31/14
• 代理公司: 武漢科皓知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 張火春

1.一株人胚肺二倍體成纖維細胞株，其特征在于,該細胞株為人胚肺二倍體成纖維細胞株Walvax-2,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC?C201055。

2.一種生產(chǎn)二價手足口病毒滅活疫苗的制備方法，該方法包括如下步驟：

A.在細胞培養(yǎng)容器中培養(yǎng)保藏號為CCTCC??C201055的人胚肺二倍體成纖維細胞株Walvax-2，得到的培養(yǎng)狀態(tài)的Walvax-2細胞；

B.分別接種手足口病毒EV71和手足口病毒COX.?A16至Walvax-2細胞，并分別培養(yǎng)EV71和COX.A16病毒感染的Walvax-2細胞；

C.當(dāng)細胞出現(xiàn)典型病變時分別收獲細胞病毒液；

D.用甲醛分別滅活病毒；

E.去除細胞碎片，濃縮病毒，并去除雜質(zhì)；

F.將手足口病毒EV71和COX.?A16滅活濃縮病毒液按1:0.5～1:1.5比例混合，并加氫氧化鋁佐劑，分裝，成為二價手足口病毒滅活疫苗。

3.根據(jù)權(quán)利要求2中所述方法，其中利用含體積百分比為2％～10％新生牛血清的MEM營養(yǎng)液在步驟A中培養(yǎng)Walvax-2細胞形成單層。

4.根據(jù)權(quán)利要求2中所述方法，其中在步驟A中以1:2～1:4的分種率接種細胞，細胞生長至對數(shù)生長期，覆蓋85～95%培養(yǎng)容器的表面。

5.根據(jù)權(quán)利要求2中所述方法，其中在步驟B中加入到Walvax-2細胞中的手足口病毒EV71或手足口病毒COX.?A16感染復(fù)數(shù)為0.001～0.1?MOI。

6.根據(jù)權(quán)利要求2中所述方法，其中在步驟B中培養(yǎng)手足口病毒EV71或手足口病毒COX.?A16的維持液為無血清的MEM營養(yǎng)液。

7.根據(jù)權(quán)利要求2中所述方法，其中在步驟C中細胞出現(xiàn)典型病變達到75%-95%時，收獲細胞病毒液。

8.根據(jù)權(quán)利要求2中所述方法，其中在步驟D中加入1:2000～1:6000的甲醛滅活，40℃滅活72小時～120小時。

9.根據(jù)權(quán)利要求2中所述方法，其中在步驟E中滅活后的病毒在4℃條件下離心，8000～10000rpm，5～10min?收集上清液；采用超濾膜超濾濃縮病毒液10倍，補加緩沖液超濾濃縮，重復(fù)2～5次；最后一次濃縮至原體積的1/50，收集濃縮液，并清洗濾膜，在Sepharose-4FF凝膠過濾柱進一步去除雜質(zhì)。

10.根據(jù)權(quán)利要求2中所述方法，其中在步驟F中每毫升二價滅活疫苗加氫氧化鋁佐劑1.0～1.2mg。

11.根據(jù)權(quán)利要求2中所述方法，其中在步驟F中每毫升二價滅活疫苗含純化的滅活EV71病毒5～80μg。

12.根據(jù)權(quán)利要求2中所述方法，其中在步驟F中每毫升二價滅活疫苗含純化的滅活COX.?A16病毒5～80μg。

13.根據(jù)權(quán)利要求2中所述方法，該方法包括如下步驟：

A.在細胞培養(yǎng)容器中培養(yǎng)保藏號為CCTCC??C201055的人胚肺二倍體成纖維細胞株Walvax-2，得到的培養(yǎng)狀態(tài)的Walvax-2細胞；

B.分別接種感染復(fù)數(shù)為0.01?MOI手足口病毒EV71和手足口病毒COX.?A16至Walvax-2細胞，并分別培養(yǎng)EV71和COX.A16病毒感染的Walvax-2細胞；

C.當(dāng)細胞出現(xiàn)典型病變達75～95%時分別收獲細胞病毒液；

D.用1:4?000甲醛在40℃，96小時分別滅活病毒；?

E.去除細胞碎片，濃縮病毒，并去除雜質(zhì)；

F.將手足口病毒EV71和COX.?A16滅活濃縮病毒液按1:0.5～1:1.5比例混合，每毫升二價滅活疫苗加氫氧化鋁佐劑1.2mg，分裝，成為二價手足口病病毒滅活疫苗。

14.權(quán)利要求1中所述Walvax-2細胞株在制備二價手足口病毒滅活疫苗中的應(yīng)用。