[發明專利]用于核酸恒溫擴增反應中防止核酸污染和指示其反應結果的方法

有效

• 申請號: 201210371448.5
• 申請日: 2012-09-28
• 公開（公告）號: CN102936623A
• 公開（公告）日: 2013-02-20
• 發明（設計）人: 袁靜;劉威;黃留玉
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍疾病預防控制所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司 11322
• 代理人: 魯兵

技術領域

本發明屬于生物技術領域中核酸的分子生物學檢測方法，特別是涉及一種用于核酸恒溫擴增反應中防止核酸污染和指示反應結果的方法。

背景技術

核酸恒溫擴增方法目前主要包括以下幾種：環介導恒溫擴增（loop－mediated?isothermal?amplification，LAMP）、切口酶核酸恒溫擴增（nicking?enzyme?mediated?amplification，NEMA）、鏈替代擴增（strand?displacement?amplification，SDA）、滾環擴增（rolling?circle?amplification，RCA）、依賴解旋酶的恒溫基因擴增（helicase－dependent?isothermal?DNA?amplification，HAD）、轉錄依賴的擴增系統（transcription－based?amplification?system，TAS）、依賴核酸序列的擴增（NASBA）又稱自主序列復制系統（self－sustained?sequence?replication，3SR）、QB復制酶擴增（Q－beta?replicase－amplified?assay）等。恒溫擴增擺脫了熱循環的限制，使其應用范圍大大增加，而且目前應用的恒溫擴增方法都有較高的敏感性和特異性，在核酸檢測中應用范圍非常廣。但敏感性高會帶來擴增物污染和假陽性的問題，從而導致反應結果判讀不準確。

其中，環介導恒溫擴增技術（LAMP）是一種快速、特異、敏感的核酸檢測方法，再加之其操作簡單，不需要昂貴復雜的儀器，近十多年發展迅速，廣泛應用于基因檢測的各個領域。雖然LAMP技術已日趨成熟，但將其真正應用到病原微生物實際臨床檢測或檢疫單位檢測病原微生物的實例卻少之又少，大多都局限于實驗室內的基因篩查，究其主要原因，就是假陽性的問題，也就是擴增產物污染不可控。因為LAMP具有非常高的敏感性，任何一點擴增物的溢出都將給LAMP實驗帶來不可控的污染問題，因此，迫切需要一種用于環介導恒溫擴增技術（LAMP）中防止核酸污染和指示反應結果的方法。

發明內容

為解決現有核酸恒溫擴增反應中擴增物易污染和易產生假陽性導致結果判讀不準確的問題，本發明的目的是提供一種用于核酸恒溫擴增反應中防止核酸污染和指示反應結果的方法。

本發明所提供的用于核酸恒溫擴增反應中防止核酸污染的方法，是將熔點低于核酸恒溫擴增反應溫度0-25℃、直徑與反應管管徑相同的柱狀全精煉固態石蠟塊或半精煉固態石蠟塊加入到反應管中反應液的上方，然后蓋上蓋，將反應管置于恒溫容器進行核酸恒溫擴增反應，在反應溫度下全精煉固態石蠟塊或半精煉固態石蠟塊融化成為液態石蠟覆蓋在反應液上表面，使反應液在封閉狀態下進行反應，反應結束后冷卻至室溫液態石蠟又恢復為固態，最后用濁度儀對反應液進行結果判讀，在整個反應過程中反應液始終與外界隔離，可達到防止核酸污染和避免結果假陽性的目的。

所述防止核酸污染的方法適用于所有恒溫核酸擴增技術，主要包括環介導恒溫擴增技術（LAMP）、切口酶核酸恒溫擴增技術、鏈替代擴增技術、滾環擴增技術、依賴解旋酶的恒溫基因擴增技術、轉錄依賴的擴增系統、依賴核酸序列的擴增技術（又稱自主序列復制系統）、QB復制酶擴增技術等，尤其適用于環介導恒溫擴增技術（LAMP）。

以環介導恒溫擴增技術（LAMP）為例，本發明防止核酸污染的方法包括以下步驟：

1）將熔點為40-60℃的全精煉固態石蠟或半精煉固態石蠟融化后導入模具后再降溫使其凝固，將石蠟制成適用于反應管大小（直徑與反應管管徑相同）的柱狀固態石蠟塊；

2）在反應管中將LAMP反應液混合好，將石蠟塊加入到反應液的上方；

3）蓋上蓋，將反應管置于60-65℃恒溫容器中進行環介導恒溫擴增反應，在反應溫度下固態石蠟塊融化成為液態石蠟覆蓋在反應液上表面，使反應液在封閉狀態下進行反應；

4）反應結束后，冷卻至室溫，待液態石蠟恢復為固態后用濁度儀進行結果判讀。