[發明專利]雙峰駝角蛋白、編碼基因及其獲取方法

無效

• 申請號: 201210371436.2
• 申請日: 2012-09-29
• 公開（公告）號: CN102993291A
• 公開（公告）日: 2013-03-27
• 發明（設計）人: 烏仁套迪;陳國華;巴拉
• 申請（專利權）人: 烏仁套迪
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/12;C12N15/10
• 代理公司: 寧夏專利服務中心 64100
• 代理人: 徐淑芬

1.一種雙峰駝角蛋白，其氨基酸序列如下述(a)或(b)所示：

(a)SEQ?ID?NO.2所示序列；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或／和疊加一個或多個氨基酸衍生得到的，且與(a)編碼蛋白質具有相同功能的保守性變異多肽、活性片段或活性衍生物的氨基酸序列。

2.一種雙峰駝角蛋白編碼基因，其核苷酸序列如下述(a)或(b)所示：

(a)SEQ?ID?NO.1所示序列；

(b)由堿基簡并或／和替代衍生的與(a)所述核苷酸序列90％以上同源性，且與(a)編碼相同功能蛋白質的序列。

3.一種雙峰駝角蛋白編碼基因的獲取方法，該方法包括如下步驟：

(1)從雙峰駝耳部組織中分離提取總RNA；

(2)根據人、鼠及牛不同物種的角蛋白基因的同源序列設計引物，進行反轉錄PCR，其中

引物的正向引物為SEQ?ID?NO.3：5’-ATGGCCACCCAGTTCTGCTCC-3’

反向引物為SEQ?ID?NO.4：Oligo?dT；

(3)克隆和測序。

4.按照權利要求3所述的雙峰駝角蛋白編碼基因的獲取方法，其特征在于從雙峰駝耳部組織中分離提取總RNA為：將雙峰駝耳部組織放入裝有Trizol的勻漿器管中勻漿，離心分離，吸取上清液，在15-30℃溫育5分鐘，加氯仿，劇烈震蕩，繼續在15-30℃溫育2-3分鐘，再次離心分離，吸取上清液，加異丙醇混合均勻，然后15-30℃溫育10分鐘，離心分離，所得沉淀物加75％乙醇洗滌，離心分離后自然干燥或真空干燥得到總RNA。

5.按照權利要求3所述的雙峰駝角蛋白編碼基因的獲取方法，其特征在于分離提取后的總RNA用分光光度計測定RNA含量和用瓊脂糖電泳分析RNA的質量。

6.按照權利要求3所述的雙峰駝角蛋白編碼基因的獲取方法，其特征在于上述反轉錄PCR按照大連寶生物反轉錄試劑盒的要求進行反轉錄。

7.按照權利要求3所述的雙峰駝角蛋白編碼基因的獲取方法，其特征在于上述克隆和測序，包括PCR擴增片段的回收、回收片段同T載體的連接、質粒的轉化、轉化菌落的PCR鑒定與培養、質粒的回收、質粒的酶切鑒定和重組質粒的測序。

8.按照權利要求7所述的雙峰駝角蛋白編碼基因的獲取方法，其特征在于上述PCR擴增片段的回收按照上海華舜小量膠回收試劑盒的要求進行。

9.按照權利要求7所述的雙峰駝角蛋白編碼基因的獲取方法，其特征在于上述回收片段同T載體的連接用TaKaRa?pMD18-T?Vector試劑盒。

10.按照權利要求7所述的雙峰駝角蛋白編碼基因的獲取方法，其特征在于上述質粒的轉化為：將感受態細胞加入到回收片段同T載體的連接產物中，冰浴30分鐘，然后在42℃水浴熱應激90秒鐘，立即置入冰浴中2分鐘，加液體LB培養基，37℃復活50分鐘，后涂布于含有氨芐青霉的LB平板上，37℃恒溫培養10-15小時。

11.按照權利要求7所述的雙峰駝角蛋白編碼基因的獲取方法，其特征在于上述轉化菌落的PCR鑒定與培養為挑選轉化培養的單菌落，放入到加有PCR反應液的EP管中晃動，使單菌落充當模板；用獲得該片段的PCR條件進行擴增，PCR產物同Marker一起進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒別T載體上是否含有目的片段；若得到目的片段，可挑取在LB平板上的與之對應的單菌落，放入含有的青霉素鈉LB液體培養基中，37℃過夜搖菌培養，用于質粒回收。

12.按照權利要求7所述的雙峰駝角蛋白編碼基因的獲取方法，其特征在于上述質粒的回收用上海華舜小量質粒抽提純化試劑盒實現。

13.按照權利要求7所述的雙峰駝角蛋白編碼基因的獲取方法，其特征在于上述質粒的酶切鑒定采用雙酶切法鑒定，選擇內切酶Bam?H?I和Hin?d?III。