[發(fā)明專利]一株暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌株

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210370467.6
• 申請(qǐng)日: 2012-09-27
• 公開（公告）號(hào): CN102870597A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何明霞;張春霞;曹旸;劉靜;紀(jì)開萍;王文兵;高鋒;周茂;伍英;王云
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 云南省熱帶作物科學(xué)研究所
• 主分類號(hào): A01G1/04
• 分類號(hào): A01G1/04
• 代理公司: 昆明今威專利商標(biāo)代理有限公司 53115
• 代理人: 楊宏珍

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一株暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌株，具體涉及一株適合制備液體菌種和袋料栽培的暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌株，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

暗褐網(wǎng)柄牛肝菌Phlebopus?portentosus隸屬于小牛肝菌科Boletinellaceae，脈柄牛肝菌屬Phlebopus。國外分布于泰國、斯里蘭卡、越南、印度尼西亞、巴西、墨西哥、澳大利亞、新西蘭等熱帶地區(qū)（Maria2007,Bandala2004,Watling2001,Barbara1987,Pegler1986,Heinemann1982）。國內(nèi)主要分布在云南，廣西、海南也有分布（臧穆等1986,2006；楊祝良和臧穆2003）。暗褐網(wǎng)柄牛肝菌含有豐富的蛋白質(zhì)、粗脂肪、總糖、粗纖維、多種礦質(zhì)元素和氨基酸，是一種營養(yǎng)價(jià)值較高的食用菌（R.Sanmee2003，張春霞等2010），深受產(chǎn)地消費(fèi)者喜愛的美味食用菌。

優(yōu)良的菌種，是決定暗褐網(wǎng)柄牛肝菌產(chǎn)量與質(zhì)量的提高和穩(wěn)定的關(guān)鍵。暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌株的獲得主要是利用野生暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實(shí)體進(jìn)行分離、純化，然后直接用于暗褐網(wǎng)柄牛肝菌的液體菌種和固體菌種的培養(yǎng)。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的在于提供一株適合制備液體菌種和袋料栽培的暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌株。

本發(fā)明從云南省西雙版納州景洪市野生牛肝菌組織分離獲得，對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、生理生化性質(zhì)和ITS-RNA分析，該菌株命名為暗褐網(wǎng)柄牛肝菌（Phlebopus?portentosus）PP10003，屬于小牛肝菌科Boletinellaceae，脈柄牛肝菌屬Phlebopus?，于2012年6月21日，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC），保藏編號(hào)為：CGMCC?No.6240。

本發(fā)明的暗褐網(wǎng)柄牛肝菌（Phlebopus?portentosus）PP10003的主要形態(tài)特征和生理生化性質(zhì)為：

該菌株的菌落在M1斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)圓形或近圓形，菌絲褐色，濃密。在光學(xué)顯微鏡下菌絲無色透明，多分支，菌絲直徑約3μm，鎖狀聯(lián)合明顯。

本發(fā)明按常規(guī)方法用常規(guī)設(shè)備制備。即將暗褐網(wǎng)柄牛肝菌（Phlebopus?portentosus）PP10003擴(kuò)大發(fā)酵培養(yǎng)后得到。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：利用該菌株制備的優(yōu)良液體菌種發(fā)菌快，菌球整齊，污染少；用于袋料栽培，其出菇培養(yǎng)時(shí)間短，出菇整齊，子實(shí)體產(chǎn)量高；能實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)暗褐網(wǎng)柄牛肝菌，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

具體實(shí)施方式：

以下是本發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：

1、菌株的分離與保藏。

在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將采來的野生暗褐網(wǎng)柄牛肝菌子實(shí)體組織塊接種到M1試管培養(yǎng)基斜面上，于28℃-30℃下暗培養(yǎng)30天，每天觀察記錄，剔除污染的試管，挑選出長勢(shì)良好的菌株，獲得暗褐網(wǎng)柄牛肝菌試管母種。切取菌絲塊置于無菌蒸餾水中15℃保存。

2、菌株P(guān)P10003的鑒定

分子鑒定：用CTAB法提取人工子實(shí)體PP10003基因組DNA，并以0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。用于真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物ITS1?（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）由華大基因合成。以提取到的PP10003基因組DNA為模板，以ITS1,ITS4為引物（用dH₂O稀釋至10mM）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系：10×PCR?buffer?5μL；10mM?dNTP?mix?4μL；Taq酶?0.5μL；引物各2μL；DNA模板2μL；加超純水補(bǔ)足至50μL。充分混合均勻后，于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件如下：94℃?4min；94℃?1min---54℃?1min---72℃?2min?35個(gè)循環(huán)；72℃?10min;12℃?∞。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,用DNA純化回收試劑盒回收600bp大小的片段，與T-載體(Takara?pMD-18T)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli?DH5ɑ?感受態(tài)細(xì)胞，然后在含有Amp，IPTG,X-Gal的?LB平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，并進(jìn)行菌落PCR篩選出陽性克隆，提取質(zhì)粒送至華大基因完成測(cè)序。

所得的測(cè)序結(jié)果經(jīng)過人工校正后獲得一段666bp的序列：

1??????GAGGGTGATG?CTAGGTGGGA?CGACTGTCGC?TGGCATATAT?CGTATGCATG?TGCACGTCGA