[發明專利]一種檢測褐色橘蚜體內CTV實時熒光定量RT-PCR的引物及其方法

無效

• 申請號: 201210370191.1
• 申請日: 2012-09-29
• 公開（公告）號: CN103088152A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 劉金香;李玲娣;周常勇;李中安;田曉
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院柑桔研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 重慶為信知識產權代理事務所(普通合伙) 50216
• 代理人: 孫人鵬

1.一種檢測褐色橘蚜體內CTV實時熒光定量RT-PCR的引物，其特征在于：其特異性引物為HD-F和HD-R，其核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.1和2所示。

2.根據權利要求1所述一種檢測褐色橘蚜體內CTV實時熒光定量RT-PCR的引物，其特征在于，所述外側引物為LD-F/LD-R，其核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.3和4所示。

3.一種檢測褐色橘蚜體內CTV實時熒光定量RT-PCR的方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)引物的設計：根據Genbank中CTVP25基因保守序列，利用Beacon?Designer?7設計引物HD-F/HD-R及其外側引物對LD-F/LD-R，并用Genbank的Blast進行比對，保證引物的特異性，在LD-F前加T7啟動子序列和保護堿基得引物LD-T7-F，引物對LD-T7-F/LD-R構建標準品cRNA；

(2)褐色橘蚜總RNA的提取；

(3)目的基因的擴增與鑒定；

(4)標準品cRNA的制備；

(5)建立熒光定量RT-PCR體系，所述熒光定量RT-PCR體系中退火溫度為60℃；引物濃度為600nm，體系如下：

5μl反轉錄體系為：2×TS?ReAction?Mix?2.5μl；TrAnsScriptTM/RI?Enzyme?Mix0.25μl；gDNA?Remover?0.25μl；HD-R?0.25μl；ddH₂O?0.25μl；蚜蟲RNA模板或標準品1.5μl；程序為：42℃反轉錄30min；85℃變性5min；

20μl實時定量PCR反應體系：2×SYBR?Green?Supermix)10μl；HD-F/R各1.2μl；ddH₂O?5.6μl；反轉錄產物cDNA模板2μl；擴增程序為：95℃預變性30s，95℃變性10s，60℃退火15s，72℃延伸20s，40個循環；擴增后采集融解曲線程序：95℃變性15s后，從65℃開始，每升高0.5℃停留30s采集熒光信號，直到溫度升高到95℃融解曲線采集完成，每個樣品3個技術重復，同時設負對照和空白對照；

(6)單頭褐色橘蚜體內CTV含量檢測。

4.根據權利要求3所述一種檢測褐色橘蚜體內CTV實時熒光定量RT-PCR的方法，其特征在于：采用上述建立的體系對在毒源植物上獲毒的單頭蚜蟲中CTV進行定量檢測，得到單頭橘蚜體內CTV含量，具體檢測為：當毒源植物開始抽梢時，用毛筆將無毒褐色橘蚜的無翅成蚜同時放置在毒源及健康植株的嫩梢上，每株毒源放置50頭，健康植株上放置10頭，當蚜蟲在毒源植株及健康植株上取食24h后，用毛筆分別將褐色橘蚜輕輕挑到以干凈的培養皿中，再隨機取20頭獲毒蚜蟲，單頭分裝于經DEPC水處理的EP管中進行抽提檢測，同時取3頭在健康植株上取食同樣時間的蚜蟲放于EP管中作為負對照與獲毒蚜蟲同時檢測得到結果。