[發明專利]一種水霉菌孢子檢測試劑及檢測方法

無效

• 申請號: 201210369174.6
• 申請日: 2012-09-27
• 公開（公告）號: CN102827945A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 呂利群;王浩;張楠
• 申請（專利權）人: 上海海洋大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及菌類檢測技術，尤其涉及一種水霉菌孢子檢測試劑及檢測方法。

背景技術

水霉病(Saprolegniasis)，又叫膚霉病(Dermatomyucosis)，是淡水魚類中最為常見的一種疾病。水霉菌是引起水生動物發生水霉病的主要病原，其適應溫度范圍廣，分布范圍亦很廣，一年四季都可以引起魚類發病。水霉菌隸屬于卵菌綱中的水霉目(Saprolegniales)、霜霉目(Peronosporales)和芽枝菌目(Blaslociadiales)，其中水霉科(Saprolegniaceae)的水霉屬(Saprolegnia)、綿霉屬(Achlya)和絲囊霉屬(Aphanomyces)最為常見，是魚卵孵化、魚類培育和成魚養殖中主要的病原體。

水霉菌對宿主無嚴格的選擇性，在水生動物的各個生長階段均有發生，主要寄生在魚體傷口和死卵上，危害養殖魚類和降低魚卵孵化率。在適當條件下，水霉菌絲發育為動孢子囊，動孢子囊內形成游動孢子，游動孢子逸出到水體中，當魚類皮膚或鰓受到機械損傷及其他病原體的傷害時，魚體抵抗力降低，水霉孢子在傷口處萌發并開始寄生。

水霉菌傳統的檢測方法主要是通過游動孢子釋放形式、有性生殖、無性生殖、菌絲形態等進行鑒定，然而這些結構的形成需要較長時間的發育，因而形態學方法難以短時間準確鑒定分離得到的水霉菌株。隨著分子生物學的快速發展，人們開始采用許多分子生物學手段，如DNA?G+C?mol％含量測定、蛋白電泳技術、DNA指紋(DNA，Fingerprinting)、核糖體rDNA內部轉錄間隔區(Internal?Transcribed?Spacer，ITS)、擴增多態性DNA(Random?amplification?of?polymorphic?DNA，RAPD)等已有效的用于水霉菌的檢測中。但由于上述手段均需要昂貴的儀器設備、繁瑣的檢測過程以及對檢測人員較高的技術要求，而使其難以在基層普及推廣。

環介導等溫擴增(LAMP)技術(國際專利公開號WO00/28082)是Notomi等在2000年開發出的一種新的核酸擴增方法，即針對靶基因的6個區域設計4條特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst?DNA?polymerase)在恒溫條件下即可完成核酸擴增反應。已經廣泛應用于細菌、寄生蟲和病毒的定性檢測。該技術較常規PCR擴增方法提高了敏感性、特異性，并且具有操作簡單、設備要求低、檢測費用較少、等溫高效的特點。目前尚未有本方案中檢測水霉菌孢子或水霉菌菌絲團的檢測方法和檢測試劑盒。

因此本發明建立了檢測水產養殖水體中水霉菌孢子或水霉菌絲團的檢測方法和水產養殖水體中水霉菌孢子或水霉菌菌絲團的檢測試劑。

發明內容

本發明的目的是要解決傳統的水產養殖水體中水霉菌孢子或其菌絲團檢測方法存在繁瑣、費時費力、特異性低、對檢測的數據處理費時且準確性難以把握的問題。為解決上述問題，本發明采用的技術方案包括水產養殖水體中水霉菌孢子或其菌絲團的檢測方法和水產養殖水體中水霉菌孢子或水霉菌菌絲團的檢測試劑。

本發明所建立的試劑盒特異性強，敏感性高；本發明水霉菌孢子或水霉菌菌絲團檢測方法利用所述試劑盒檢測，該方法方便、靈敏、準確、快速、便捷。

本發明提供的檢測試劑包括以下組分：

(1)檢測反應液：20mmol/L?Tri-HCl；10mmol/L(NH₄)₂5O₄；10mmol/LKCL；0.1％Triton?X-100；MgSO₄10mmol/L、dNTPs1mmol/L、Betaine0.6mmol/L、內引物(FIP和BIP)各1.5μmol/L、外引物(F3和B3)各0.8μmol/L及8U?Bst?DNA聚合酶大片段。

其中內引物FIP和BIP，外引物F3和B3分別是

SP-FIP：

GTTGTATTTCAATTGCATGCAGACATGAATCCTTTTTAAACTACGACTG

SP-BIP：

TTCAACAGTGGATGTCTAGGCTCACTGAATTCTGCAATTCGC

SP-F3：GCAAGAAGCCGATGTCAAT

SP-B3：GCGTTCAAAATTTTGATGACT。

(2)反應顯色液：10％SYBR?Green熒光染料/TAE緩沖液；

(3)核酸裂解液：