[發(fā)明專(zhuān)利]應(yīng)用基于小麥EST序列的黑麥染色體特異分子標(biāo)記對(duì)黑麥5R染色體進(jìn)行鑒定的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210366548.9
• 申請(qǐng)日: 2011-04-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103045724A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許紅星;尹冬冬;安調(diào)過(guò);李立會(huì)
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 石家莊匯科專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所 13115
• 代理人: 王琪;周大偉

1.應(yīng)用基于小麥EST序列的黑麥染色體特異分子標(biāo)記對(duì)黑麥5R染色體進(jìn)行鑒定的方法，其特征步驟包括：

A、分子標(biāo)記的選定和制備：合成標(biāo)記引物“11-MAG1242”，其正向引物序列見(jiàn)SEQ?ID?NO：21，其反向引物序列見(jiàn)SEQ?ID?NO：22；

B、標(biāo)記引物的稀釋?zhuān)簩⑸喜胶铣傻臉?biāo)記引物，先用1×TE緩沖液溶解成100mmol?L^-1的母液放入-20℃的冰箱中保存，使用前吸取母液用超純水稀釋成10mmol?L^-1的工作液待用；其中1×TE緩沖液的配方為，10mmol?L^-1?Tris-HCl與1mmol?L^-1?EDTA，pH=8.0；

C、黑麥染色體的特異標(biāo)記：

C-1、模板DNA的提取：取待測(cè)物——小麥與黑麥的遠(yuǎn)緣雜交后代材料，對(duì)照物0——不包含待測(cè)黑麥染色體的樣品，對(duì)照物1——包含待測(cè)黑麥染色體的樣品，然后利用常規(guī)DNA提取方法分別提取三者的DNA；

C-2、PCR擴(kuò)增：以C-1所得DNA樣品為模板，利用步驟B所得工作液在PCR擴(kuò)增儀中分別對(duì)待測(cè)物、對(duì)照物0及對(duì)照物1進(jìn)行擴(kuò)增；

C-3、擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)：非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)步驟C-2所得的擴(kuò)增產(chǎn)物，用銀染法進(jìn)行染色，并在凝膠成像儀上照相；

C-4、結(jié)果比對(duì)：將待測(cè)遠(yuǎn)緣雜交后代材料的電泳圖譜分別與對(duì)照物0、對(duì)照物1的電泳圖譜進(jìn)行比對(duì)，如果待測(cè)遠(yuǎn)緣雜交后代材料和對(duì)照物1的電泳圖譜均有特異擴(kuò)增片段，說(shuō)明遠(yuǎn)緣雜交后代材料中有待測(cè)黑麥染色體；如果待測(cè)遠(yuǎn)緣雜交后代材料的電泳圖譜與對(duì)照物0的電泳圖譜一致，均不含有特異擴(kuò)增片段，說(shuō)明遠(yuǎn)緣雜交后代材料中不含有待測(cè)黑麥染色體。

2.根據(jù)權(quán)力要求1所述的對(duì)黑麥染色體進(jìn)行鑒定的方法，其特征在于：步驟C-2中對(duì)所述待測(cè)物、對(duì)照物0及對(duì)照物1的DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增的具體操作為，在體積為0.2ml的Eppendof管中依次加入30ng的模板DNA，1×PCR?buffer，1.5mmol?L^-1?MgCl₂，200mmol?L^-1?dNTP，正、反向引物各0.2mmol?L^-1，0.5U?Taq?DNA聚合酶，最后用無(wú)菌超純水補(bǔ)充反應(yīng)體系至10ml，然后將Eppendof管放在GeneAmp9700基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

3.根據(jù)權(quán)力要求2所述的對(duì)黑麥染色體進(jìn)行鑒定的方法，其特征在于：所述擴(kuò)增反應(yīng)的具體程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；然后94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，循環(huán)38次；最后72℃延伸10min，10℃保存。

4.根據(jù)權(quán)力要求1所述的對(duì)黑麥染色體進(jìn)行鑒定的方法，其特征在于：步驟C-3中所述擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)方法具體為，在步驟C-2所得的擴(kuò)增產(chǎn)物中加入上樣緩沖液2μl，混勻之后取3μl用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，電泳電壓為150～180V，電泳1～2h。