[發明專利]水稻植酸相關基因ZJU-LPA1及培育低植酸水稻的方法

無效

• 申請號: 201210364575.2
• 申請日: 2012-09-26
• 公開（公告）號: CN102864156A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發明（設計）人: 趙海軍;舒慶堯;劉慶龍;崔海瑞;李珊
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415;A01H1/06;C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

技術領域

本發明屬于植物基因工程領域，具體的說，本發明涉及一種利用圖位克隆技術克隆的水稻植酸相關基因ZJU-LPA1以及利用該基因培育低植酸水稻的方法。

背景技術

植酸是作物種子中最豐富的磷的貯存形式，占種子中全磷量的65～85％。植酸可與Zn²⁺、Fe³⁺、Ca²⁺等金屬陽離子螯合成植酸鹽，難以被人和非反芻動物(豬、雞、魚等)消化利用，降低了磷元素以及與之結合的微量元素、蛋白和淀粉的生物有效性，被認為是一種抗營養因子；此外，植酸還對生態環境具有負面效應，可引起湖泊等水系的富營養化。因此，降低植酸的含量成為育種學家、營養學家和環境學家關注的焦點之一。運用理化誘變和轉基因技術，獲得種子中植酸含量下降的低植酸(LPA)作物，可從源頭上解決上述問題。

迄今，國內外已在水稻、大豆、玉米、大麥、小麥等作物中獲得了一批LPA突變體，這些突變體不僅為LPA作物品種的選育及應用奠定了基礎，也為進行LPA突變基因的定位、克隆研究提供了理想材料。利用正向(圖位克隆)或反向遺傳學(RNAi，T-DNA插入突變)技術，已克隆了若干LPA基因，揭示了LPA突變發生的分子機制。

植物體內的植酸代謝較為復雜，迄今還未明確。其合成代謝的大致途徑如下：葡萄糖-6-磷酸在肌醇-3-磷酸合成酶(MIPS)的催化下生成肌醇-3-磷酸[Ins(3)P₁]，接著在肌醇單磷酸酶的作用下生成肌醇和無機磷；后期為肌醇磷酸化/焦磷酸肌醇-磷酸化階段，即肌醇和磷通過脂依賴和/或非脂依賴途徑生成三磷酸肌醇，三磷酸肌醇經連續的磷酸化最終生成植酸。因此，植酸代謝或運輸途徑中任一基因突變或沉默均會導致降低植酸含量。如：大豆和水稻中MIPS基因的沉默；水稻和玉米中肌醇激酶(MIK)的突變；玉米、擬南芥和大豆中肌醇單磷酸激酶(IPK)的突變；玉米、大豆和水稻中植酸運輸相關基因(MPR)基因的突變；水稻中與擬南芥中2-膦酸甘油酸激酶(2-PGK)同源基因的突變。

我國是稻米生產和消費的大國，也是鐵缺乏和缺鐵性貧血發生較嚴重的國家之一，培育具有營養與環保雙重功能的LPA水稻在我國尤為重要。而獲得具有自主知識產權的LPA相關新基因，則為通過傳統育種手段或現代反向遺傳學技術培育LPA水稻新品種提供了必要的前提，也為闡明植酸合成代謝途徑奠定基礎，具有重要的理論與實踐意義。

發明內容

本發明提供了一種水稻植酸相關基因ZJU-LPA1，通過人工突變該基因或RNAi抑制該基因表達，可以有效降低水稻種子中的植酸含量。

一種水稻植酸相關基因ZJU-LPA1，其堿基序列如SEQ?ID?NO.1所示。

一種所述水稻植酸相關基因ZJU-LPA1編碼的蛋白質，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

本發明還提供了一種培育低植酸水稻的方法，包括：

利用射線對水稻種子進行射線誘變處理，種植若干代后，篩選水稻ZJU-LPA1基因表達框被破壞的純合型突變體；

所述水稻ZJU-LPA1基因的堿基序列如SEQ?ID?NO.1所示。

所述水稻種子的品種為三系晚秈恢復系“明恢86”和三系秈稻恢復系“中9B”。

所述射線為¹³⁷Cs-γ射線。

所述射線誘變劑量為300Gy。

本發明提供了另一種培育低植酸水稻的方法，包括：

(1)構建ZJU-LPA1基因RNAi的發夾結構單元；

(2)將所述發夾結構單元連入中間載體，構建植物表達載體；

(3)將所述植物表達載體通過農桿菌介導轉化水稻愈傷組織；

(4)將水稻愈傷組織轉移到選擇性培養基上繼續培養，待分化成苗，移栽大田，篩選獲得低植酸水稻植株。

所述發夾結構單元包括中間的內含子及兩端的目的基因片段和目的基因片段的反向互補片段，所述目的基因片段為ZJU-LPA1基因CDS序列的部分序列，ZJU-LPA1基因CDS堿基序列如SEQ?ID?No.3所示，內含子在本發明中沒有特異性的要求，它可以是來自pSSK-IN載體，堿基序列如SEQ?ID?NO.24所示。

擴增所述目的基因片段的引物為：