[發(fā)明專利]微孔陣列芯片及其制造方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210363985.5
• 申請日: 2004-09-22
• 公開（公告）號: CN102928584A
• 公開（公告）日: 2013-02-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 村口篤;岸裕幸;時光善溫;近藤佐千子;小幡勤;藤城敏史;橫山義之;鍋澤浩文;高林外廣;谷野克巳
• 申請（專利權(quán)）人: 富山縣政府;維渦里斯公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 郭文潔;權(quán)陸軍

本申請是申請日為2004年9月22日，申請?zhí)枮?00480034519.6的、發(fā)明名稱和本發(fā)明相同的發(fā)明專利申請的分案申請。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明的第一方案涉及可用于抗原特異性淋巴細胞等生物體細胞的檢測等的微孔陣列芯片。本發(fā)明的第一方案特別涉及可容易地進行微孔定位的微孔陣列芯片(Microwell?Array?Chip)。

本發(fā)明的第二方案涉及微孔對生物體細胞的捕集率和收集率均優(yōu)異的微孔陣列芯片及其制造方法。

本發(fā)明的第三方案涉及可用于抗原特異性淋巴細胞等生物體細胞的檢測等的硅制微孔陣列芯片。本發(fā)明的第三方案特別涉及根據(jù)需要，可容易地將容納在微孔中的生物體細胞進行回收的微孔陣列芯片。

背景技術(shù)

以往，抗原特異性淋巴細胞通過例如使用96孔板，每孔加入約200,000個淋巴細胞，在抗原存在下培養(yǎng)3天至一周，由此進行檢測(“リンパ球機能檢索法”矢野純一、藤原道夫編著，中外醫(yī)學(xué)社(1994年)；“免疫實驗操作法I、II”右田俊介、紺田進、本庶佑、濱岡利之編集，南江堂(1995年))。該方法中，可確認約200,000個淋巴細胞群中存在抗原特異性淋巴細胞。但是無法鑒定存在于淋巴細胞群中的各抗原特異性淋巴細胞。

對于此，近年來人們開發(fā)利用了通過將用熒光染料標記的抗原分子與淋巴細胞混合，來使熒光標記抗原與抗原特異性淋巴細胞的抗原受體結(jié)合，再使用流式細胞儀檢測結(jié)合有熒光標記抗原的淋巴細胞的方法(Altman?JD，Moss?PA，Goulder?PJ，Barouch?DH，McHeyzer-Williams?MG，Bell?JI，McMichael?AJ，Davis?MM.Phenotypic?analysis?of?antigen-specific?T?lymphocytes(抗原特異性T淋巴細胞的表型分析)，Science，274：94-96，1996)。該方法可以鑒定與抗原結(jié)合的1個淋巴細胞。還可以分選1個與抗原結(jié)合的淋巴細胞。

但是，上述檢測方法中，為了分選，必須有細胞分選儀這樣高價且復(fù)雜的儀器，并且還有以下的問題。

(1)用于分選的儀器條件設(shè)定較難，用于分選細胞的儀器操作必須熟練。

(2)由于背景噪聲高，抗原特異性淋巴細胞的頻度為0.1％以下時，無法檢測抗原特異性淋巴細胞。

(3)分選細胞的效率低。

(4)分選頻度低的細胞需要時間。

(5)可以確認有抗原結(jié)合，但難以對結(jié)合有抗原的淋巴細胞的反應(yīng)進行分析。

作為其它的抗原特異性淋巴細胞檢測法，還開發(fā)出通過將與磁珠結(jié)合的抗原分子與淋巴細胞混合，使結(jié)合有磁珠的抗原與抗原特異性淋巴細胞的抗原受體結(jié)合，使用磁石分選抗原特異性淋巴細胞的方法(Abts?H，Emmerich?M，Miltenyi?S，Radbruch?A，Tesch?H，CD20positive?human?B?lymphocytes?separated?with?the?magnetic?sorter(MACS)can?be?induced?to?proliferation?and?antibody?secretion?in?vitro.Journal?of?Immunological?methods?125：19-28，1989.)。

該方法無需復(fù)雜的裝置，細胞分選所需的時間短，可以確認有抗原結(jié)合。但無法對結(jié)合有抗原的淋巴細胞是否與抗原反應(yīng)(細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA合成、蛋白質(zhì)合成等細胞的代謝生理反應(yīng))進行分析。另外，抗原特異性淋巴細胞的頻度為0.1％以下時，無法檢測抗原特異性淋巴細胞。

而本發(fā)明人對于提供無需復(fù)雜的裝置、細胞分選時間短、可確認有抗原結(jié)合、也可檢測頻度低的抗原特異性淋巴細胞(0.001％以上)、可以對結(jié)合有抗原的淋巴細胞是否與抗原反應(yīng)進行分析、并且可分選抗原特異性淋巴細胞的抗原特異性淋巴細胞檢測方法進行了各種研究。對個別檢測一個個淋巴細胞的抗原特異性、并且回收檢測出的抗原特異性淋巴細胞的方法進行了開發(fā)。

但是，目前為止尚未知有可個別檢測一個個淋巴細胞的抗原特異性，并可回收所檢測的抗原特異性淋巴細胞的微孔陣列芯片。