[發明專利]一種表達抗凝血酶III的重組羊胎兒成纖維細胞

無效

• 申請號: 201210362487.9
• 申請日: 2012-09-25
• 公開（公告）號: CN102899292A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發明（設計）人: 鄒賢剛;趙雅琳;袁三平
• 申請（專利權）人: 青島森淼實業有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;A01K67/027;C12R1/91
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

技術領域

本發明屬于轉基因克隆細胞技術領域，具體涉及一種表達抗凝血酶III的重組羊胎兒成纖維細胞。

背景技術

抗凝血酶III（antithrombinIII，簡稱ATIII）屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑，是人體血漿中的一種重要的抗凝血因子，它在血漿中承擔著60%～70%的抗凝血活性，在維持血液生理性凝血與抗凝血中起著重要的作用。抗凝血酶III的合成場所為肝臟，其主要通過與凝血酶Xa及XIa結合等方式滅活凝血酶，從而發揮抗凝血的作用。抗凝血酶III在人體中含量減少常見于以下病例：

a）遺傳性抗凝血酶III缺乏；

b）獲得性抗凝血酶III缺乏，見于肝硬化、肝癌晚期等各種肝臟疾病；

c）抗凝血酶III丟失增多，見于腎臟疾病；

d）抗凝血酶III消耗增多，見于各種原因造成的血液凝固性增高；

e）由抗凝血酶III先天或后天缺乏導致血栓的形成而引起的腦血栓或心肌梗塞等疾病。

目前人抗凝血酶III蛋白多來自于人類血漿提取，隨著市場需求的不斷擴增以及血漿原料的不斷萎縮，血漿來源的人抗凝血酶III逐漸呈現出供不應求的態勢。鑒于此種情況，利用重組DNA技術在體外高效表達與天然蛋白結構功能均類似的重組蛋白替代品便成為了解決血漿蛋白供不應求的不二之選。

已有報道的重組人抗凝血酶III蛋白表達體系包括酵母、CHO細胞及轉基因動物等。其中美國GTC生物治療公司的顯微注射法轉基因胚胎所培育的山羊乳腺生物反應器表達體系所生產達到重組人抗凝血酶III蛋白表達量最高，其結構與功能最接近天然蛋白。但是，GTC公司所制作的轉基因細胞系（胚胎），由于隨機整合等因素，難以保持外源基因的穩定遺傳，一般外源基因會隨細胞系傳代或轉基因動物繁育而逐漸丟失，不利于優良轉基因形狀的保持及目的蛋白的高效表達。因此，如何獲得一種能夠高效表達目的蛋白且外源基因可以隨之穩定遺傳的細胞系，成為了動物生物反應器制藥行業一項亟待解決的難題。

發明內容

本發明的目的是提供一種表達抗凝血酶III的重組羊胎兒成纖維細胞，即一種作為核供體細胞的包含rhATIII乳腺特異性表達載體的奶山羊胎兒成纖維細胞系，為制作高質量的rhATIII轉基因奶山羊反應器提供堅實的基礎，從而彌補現有技術的不足之處。

本發明的表達抗凝血酶III的轉hATIII基因成纖維細胞SMlsCh-AT已于2012年8月15日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC?C?2012103?。

本發明的重組羊胎兒成纖維細胞的制備方法，是將攜帶有整合了人的抗凝血酶III蛋白基因的表達載體轉染入羊胎兒成纖維細胞內，再篩選出目的基因rhATIII已整合到基因組上的山羊胎兒成纖維細胞。

本發明的重組羊胎兒成纖維細胞在制備奶山羊生物反應器中的應用。

本發明通過構建的rhATIII乳腺特異性表達載體，使目的基因rhATIII整合到羊胎兒成纖維細胞的基因組上。通過在rhATIII基因兩端克隆山羊β酪蛋白基因的5’和3’調控區，山羊β酪蛋白基因的5’和3’調控區可以指導目的基因在山羊乳腺組織中特異的高效表達。而且，本發明使用基因打靶技術，使含有目的基因rhATIII的特異性表達載體可以定點整合至山羊胎兒成纖維細胞基因組中，避免了由于隨機整合而對目的基因表達帶來的不確定性，使目的基因rhATIII的表達效率更高。本發明的包含目的基因rhATIII的山羊胎兒成纖維細胞可作為核移植構建轉基因克隆胚的核供體細胞，通過體細胞核移植法獲得轉基因克隆胚，將所得胚胎移入受體羊的子宮即可高效率生產出轉rhATIII基因的奶山羊生物反應器。

具體實施方式

本發明首先是構建攜帶有抗凝血酶III（ATIII）基因的重組表達載體,載體構建方法可以參照申請號為2011102521955的專利說明書中的描述來進行，其具體步驟如下：

1、包含目的基因rhATIII的重組載體構建

從人類肝臟組織中提取總RNA，以oligo(dT)為引物合成cDNA第一鏈。以合成的cDNA第一鏈為模板，根據已公開的ATIII基因序列（GenBank，D29832）設計PCR引物，并在引物5’端引入一個唯一的Xho1酶切位點，進行PCR擴增，將PCR產物克隆至pUC19載體上，通過DNA測序分析確定載體所包含的ATIII序列與已公開ATIII序列一致。

上述的ATIII基因序列也可以根據GenBank中記錄的序列人工合成。

2、重組基因打靶表達載體的構建