[發明專利]一種棘孢木霉菌的篩選方法及其應用

無效

• 申請號: 201210361866.6
• 申請日: 2012-09-26
• 公開（公告）號: CN102876586A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 曾西柏;蘇世鳴;蔣細良;白玲玉;李蓮芳
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院農業環境與可持續發展研究所
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12Q1/02;B09C1/10;C12R1/885
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技術領域

本發明涉及真菌的篩選方法及其應用，尤其涉及棘孢木霉菌(Trichoderma?asperellum)的篩選方法及其應用。

背景技術

砷是一種在自然界廣泛存在的有毒并且致癌的非金屬元素，砷污染已成為全球危害十分嚴重的環境問題之一。據報道，全球至少5000多萬人口正面臨著地方性砷中毒的威脅，其中大多數為亞洲國家，中國是受砷中毒危害最為嚴重的國家之一，在1956-1984年二十多年間，中國曾發生過30余起地砷中毒事件。我國是砷礦大國，砷礦廣泛分布在我國的中南和西南的湖南、云南、廣西、廣東等省區，砷礦開采或冶煉，含砷農藥、化肥等農資產品的過量投入等，可造成土壤在砷的累積，進而影響著植物、動物的生長和發育，且可以通過食物鏈進入人體，對人類的生存和健康構成威脅。

目前常用的砷污染土壤修復方法包括土壤改良劑法、客土法、化學沖洗法以及生物修復方法等。

生物修復方法是利用生物(主要是植物、微生物)的作用來消減、凈化土壤中的砷或改變砷的結合形態和價態，被普遍認為是砷污染環境治理中最具應用前景的技術。其中，利用超富集植物去除土壤中砷的植物修復技術在最近幾年中取得了突破性的進展，蜈蚣草(Brakefern，Pteris?vitta)和大葉井口邊草(Pteris?nervosa)等砷超富集植物相繼被發現，并可用于砷污染地區的土壤修復。在重金屬污染土壤的生物修復技術中，除應用超富集植物吸收和富集重金屬外，利用植物、微生物將土壤中的重金屬轉化為難溶態或氣態化合物形式揮發到大氣中，從而達到鈍化甚至去除土壤中重金屬的目的，也逐漸引起了人們的重視。如Terry等利用微生物和植物的作用，將環境中的硒(Se)轉化為生物毒性較低的氣態形式(二甲基硒和二甲基二硒)，將其直接或通過植物的組織揮發到大氣中。Meagher等將細菌體內的汞(Hg)還原酶基因轉入芥子科植物Arabidopsis后，得到的轉基因植物能耐受、吸收土壤環境中的Hg，并將Hg²⁺還原成Hg⁰使其揮發進入大氣。土壤中的砷化合物也可以轉變為氣態的甲基砷等物質，在多個圈層中遷移和轉化。因此，利用某些微生物的對砷的富集、利用和轉化等功能，將砷累積到生物體內或使其轉化為易揮發態的砷化合物，已成為潛在的砷污染土壤修復技術之一。

目前，國內還沒有對砷具有生物累積與揮發能力真菌的報道，國外的相關報道也屈指可數，且大多數還局限于實驗室研究階段。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種棘孢木霉菌的篩選方法，將棘孢木霉菌應用于治理砷污染土壤以及減少砷在作物和農產品中的累積。

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種棘孢木霉菌的篩選方法，包括：

采集砷污染土壤樣品，在實驗室內從該土壤樣品中分離出真菌，將該真菌純化后轉接于木霉菌屬的選擇性的培養基上；以該選擇性培養基上生長狀況最好的真菌菌株為對象，將該真菌在不同砷濃度下培養，并觀察菌落的生長狀況及其對砷的耐性，由此篩選出棘孢木霉菌。

該棘孢木霉菌Trichoderma?asperellum已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址標注在后)保存，保存編號為CGMCC?No.3186，保存日期為2009年7月09日。

優選地，該方法具體包括：

將該土壤樣品經梯度稀釋后涂布于砷含量為400～600mg/L的馬丁培養基上分離出該真菌；

將分離出的真菌經多次純化后，分別挑取少量菌絲，于不含砷的PGP培養基上用劃線法純化培養3-5天，該過程重復2次；然后接種于木霉菌屬的選擇性培養基上，于24～26℃下培養5-7天后，以生長狀況最好的真菌菌株作為接種目標，取直徑zDDY為8～10mm的圓形真菌菌塊或邊長為8～10mm的方形真菌菌塊，置于含砷1000mg/kg的PGP培養基上，比較該菌塊的生長狀況，從中篩選出具有較高抗砷能力的棘孢木霉菌菌株。

優選地，

馬丁培養基的成分包括：葡萄糖、蛋白胨、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、瓊脂以及水，各成分的重量比為20∶10∶2∶1∶80∶4000；

PGP培養基的成分包括：馬鈴薯、葡萄糖、蛋白胨以及水，各成分的重量比為40∶4∶1∶400；