[發(fā)明專利]一種高效表達(dá)枯草芽孢桿菌L-天冬酰胺酶的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210360554.3
• 申請(qǐng)日: 2012-09-20
• 公開（公告）號(hào): CN102864163A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 饒志明;賈明媚;徐美娟
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/75
• 分類號(hào): C12N15/75;C12N1/21;C12N9/82;C12Q1/34;C12R1/125
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技術(shù)領(lǐng)域

一種高效表達(dá)枯草芽孢桿菌L-天冬酰胺酶的方法，本發(fā)明屬于酶基因工程和酶工程領(lǐng)域。具體地說(shuō)涉及一種L-天冬酰胺酶基因工程菌及其構(gòu)建方法。

技術(shù)背景

L-天冬酰胺酶(EC?3.5.1.1)是一種有抗癌活性的蛋白酶，能專一催化L-天冬酰胺水解成天冬氨酸和NH₃。L-天冬酰胺酶的生理作用主要表現(xiàn)為對(duì)某些腫瘤的抑制作用，尤其對(duì)急性白血病和惡性淋巴腫瘤有效。L-天冬酰胺酶已成為治療白血病非常有效的藥物，對(duì)骨髓沒有抑制作用。

L-天冬酰胺酶可以減少食物中丙烯酰胺的生成。丙烯酰胺主要是由食品原料中的還原糖和天冬酰胺在高溫加熱過(guò)程中通過(guò)美拉德反應(yīng)生成，在食物中加入天冬酰胺酶可以水解天冬酰胺，從源頭上減少丙烯酰胺的生成。

從1953年Kidd觀察到豚鼠血清有破壞Gardner癌細(xì)胞的作用，1961年Broom證實(shí)豚鼠血清中的抗腫瘤因子為L(zhǎng)-天冬酰胺酶，1964年Mashburn等從Escherichia?coli中部分提純了L-天冬酰胺酶，并證實(shí)這種酶也有抗腫瘤因子的作用，2004年Amrein等提出用L-天冬酰胺酶代替其他方法減少食物中丙烯酰胺含量，2009年Hendriksen等研究證明在高溫處理食品時(shí)加入L-天冬酰胺酶不會(huì)產(chǎn)生危害，同時(shí)有眾多學(xué)者通過(guò)具體的實(shí)驗(yàn)證明L-天冬酰胺酶可以降低炸土豆片、馬鈴薯干粉、面團(tuán)等食物中丙烯酰胺的含量。這些研究不僅證明了L-天冬酰胺酶具有抗癌效果，同時(shí)也為臨床研究和大量生產(chǎn)創(chuàng)造了條件。

一些微生物、哺乳動(dòng)物及植物被證實(shí)含有L-天冬酰胺酶。因?yàn)閯?dòng)物血清中L-天冬酰胺酶含量低，且提取工藝復(fù)雜，微生物具有易培養(yǎng)，成本低等優(yōu)點(diǎn)，成為學(xué)者研究的重點(diǎn)，目前研究的產(chǎn)L-天冬酰胺酶微生物主要包括Escherichia?coli、Erwinia?carotovora、Erwinia?chrysanthemi等，但野生菌株L-天冬酰胺酶產(chǎn)量低，近年來(lái)利用基因工程技術(shù)將L-天冬酰胺酶基因克隆到大腸桿菌中，獲得L-天冬酰胺酶的高效表達(dá)，利用工程菌產(chǎn)L-天冬酰胺酶已成為一個(gè)重要來(lái)源。

L-天冬酰胺酶有兩種類型，L-天冬酰胺酶I和L-天冬酰胺酶II，Escherichia?coli、Erwinia?chrysanthemi、B.subtilis等均包含這兩種L-天冬酰胺酶，研究證實(shí)僅L-天冬酰胺酶II具有抗癌作用，來(lái)自Escherichia?coli和Erwinia?chrysanthemi的L-天冬酰胺酶II已被開發(fā)為治療急性淋巴細(xì)胞白血病的有效藥物，目前研究的大部分是具有抗腫瘤效果的L-天冬酰胺酶II。

本發(fā)明通過(guò)表達(dá)載體pMA5，實(shí)現(xiàn)了B.subtilis?6-7L-天冬酰胺酶II(簡(jiǎn)稱ansZ)的高效表達(dá)。枯草芽孢桿菌作為安全穩(wěn)定的工業(yè)生產(chǎn)菌株，培.養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，發(fā)酵周期短，成為微生物產(chǎn)L-天冬酰胺酶的潛在菌株。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所使用菌種為B.subtilis?6-7，該菌株前期用于發(fā)酵葡萄糖合成2，3-丁二醇，已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為：CTCCM?2009200。

本發(fā)明的主要研究?jī)?nèi)容：本發(fā)明利用分子技術(shù)克隆了來(lái)自B.subtilis?6-7的L-天冬酰胺酶基因(簡(jiǎn)稱ansZ)，構(gòu)建重組表達(dá)載體pMA5-ansZ，并將其轉(zhuǎn)化B.subtilis168，成功構(gòu)建了基因工程菌pMA5-ansZ/B.Subtilis168。對(duì)構(gòu)建的基因工程菌進(jìn)行酶活測(cè)定，發(fā)現(xiàn)重組菌的酶活為22.4U/mL，出發(fā)菌株酶活僅為0.039U/mL，重組菌酶活較出發(fā)菌提高了574倍。

本發(fā)明采取的技術(shù)方案：

一種L-天冬酰胺酶基因工程菌，是將出發(fā)菌株B.subtilis?6-7L-天冬酰胺酶基因連接在表達(dá)載體pMA5上，并轉(zhuǎn)化B.subtilis168得到的工程菌株。

重組菌株構(gòu)建方法

(1)L-天冬酰胺酶引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI枯草芽孢桿菌全基因組核酸序列中ansZ基因序列，設(shè)計(jì)L-天冬酰胺酶基因的PCR引物P1和P2。

P1：5’-GAC?GGA?TCC?ATG?AAA?AAA?CAA?CGA?ATG?CT-3’(BamH?I)

P2：5’-GGC?ACG?CGT?TTAATA?CTC?ATT?GAAATAAG-3’(Mlu?I)

(2)重組表達(dá)載體pMA5-ansZ的構(gòu)建