[發明專利]利用調控蛋白ALsR適度加強枯草芽孢桿菌乙偶姻合成

有效

• 申請號: 201210360503.0
• 申請日: 2012-09-20
• 公開（公告）號: CN102876703A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 饒志明;張顯;楊套偉;徐美娟;李靜靜;張靜;劉俊佳
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N1/21;C12P7/26;C12R1/125
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技術領域

利用正向調控蛋白適度加強枯草芽孢桿菌乙偶姻合成途徑，屬于生物工程中基因技術與發酵技術領域。?

技術背景

乙偶姻(3-羥基-2-丁酮)，為淡黃色液體，長期放置生成二聚體，微溶于水和乙醇、丙二醇等有機熔劑，熔點15℃，沸點143～148℃。?

乙偶姻自然界存在于玉米、葡萄、可可、蘋果、香蕉、干酪、肉類等許多食品中。是一種應用廣泛、令人喜愛的食用香料，并且在其它眾多行業中也有廣泛的應用。?

在食品中的應用：主要用作奶油、乳品、酸奶和草莓型等香料的生產，國家標準GB2760-86規定其為允許使用的食品香料。80％含量的乙偶姻俗稱“醋嗡”，是酒類調香中一個極其重要的品種。該產品因其應用范圍極其廣泛，用量也較大，是奶用、酒用香料中的重要品種。在制藥行業采用乙偶姻和光氣為原料合成重要醫藥中間體CDMDO，乙偶姻還可以合成抗菌藥倫氨芐西林鹽酸鹽。在化工行業乙偶姻可以合成起泡劑、殺菌和殺蟲劑，含氯聚合物的穩定劑，另外乙偶姻還是一種昆蟲的性激素。?

乙偶姻生產方法主要包括化學合成法、酶轉化法和微生物發酵法。化學合成法生產乙偶姻存在著產品收率和得率較低，且環境污染較嚴重等缺點，而且產品質量很難達到目前乙偶姻的最大消費領域——食用香料的要求；更為嚴重的是這三種工藝的原料來源受阻，導致了適用化學法生產乙偶姻難以大規模發展。酶法轉化法生產乙偶姻產物得率高，沒有其它副產物，并且產物具有旋光度，但要獲得大量特異性的酶比較困難。發酵法生產乙偶姻首先成本較低，其次對環境污染也較小，并且以葡萄糖為底物發酵生產乙偶姻大大減輕了原料來源的限制。目前，發酵法生產乙偶姻的方法，國內外還大都處在研究階段。?

本課題組前期研究發現：過量表達枯草芽孢桿菌代謝途徑中的某一個酶，會使得整個菌體的代謝變慢，代謝流的協調性降低，并且過量表達的蛋白造成了代謝能量的浪費。因此需要一個較弱的啟動子來適度的加強表達代謝途徑中的關鍵酶來加強某一產物的代謝流。課題組在研究枯草芽孢桿菌bdhA基因的同時，發現其上游啟動子結構導致該啟動子的啟動效率較低，因此構建了具有適度加強型啟動子PbdhA的枯草芽孢桿菌表達質粒pMA5-PbdhA。?

枯草芽孢桿菌利用糖制原料合成乙偶姻的過程首先是通過EMP途徑將葡萄糖轉變成丙酮酸；其次是在α-乙酰乳酸合成酶(ALSS)的催化下合成α-乙酰乳酸；然后在α-乙酰乳酸脫羧酶(ALSD)的作用下生成乙偶姻，乙偶姻又會在乙偶姻還原酶/2，3-丁二醇脫氫酶的作用?下和2，3-丁二醇相互轉換。研究結果表明在Bacillus?subtilis?168中分別單一的過量表達ALSS和ALSD不僅沒有提高乙偶姻的產量，還使得工程菌的生長速率及底物消耗速率下降。文獻報道編碼ALSS和ALSD的基因alsS和alsD在同一個操縱子中，并且受到alsR編碼的調控蛋白ALsR的正向調控作用。?

基于以上基礎，本發明利用PbdhA來適度加強表達alsR基因，使得乙偶姻合成途徑中由丙酮酸到乙偶姻支路中的兩個酶同時受到ALsR正向調控作用，最終使得乙偶姻和2，3-丁二醇的總產量提高。?

發明內容

本發明的主要研究內容：利用分子技術分別克隆了來自實驗室前期篩選得到的Bacillus?subtilis?JNA(保藏號CCTCC?M209309?2009.12.21；專利申請公布號CN?101864381A)的PbdhA和alsR基因，構建重組表達載體pMA5-PbdhA-alsR，并將其轉化Bacillus?subtilis?168，成功構建基因工程菌pMA5-PbdhA-alsR/B.subtilis?168。對該菌的酶活力及發酵性能進行研究發現：乙偶姻合成途徑相關酶的活力得到加強并且乙偶姻的生產效率得到提高，為微生物發酵生產乙偶姻的工業化提供了有益的指導。?

本發明的技術方案：?

1.引物設計及PCR條件?