[發明專利]一種人臍靜脈內皮細胞HUVEC的分離培養及傳代方法

在審

• 申請號: 201210359405.5
• 申請日: 2012-09-25
• 公開（公告）號: CN102827805A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 黃午陽;李春陽;閆征;王興娜;王帆;王健
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種人臍靜脈內皮細胞HUVEC的分離方法，包括了以下步驟：

1)取當天新生兒15-20cm長的新鮮臍帶，放入無菌含雙抗的PBS溶液中4℃儲存。

2)用一個鈍頭的針頭扎入臍帶靜脈管中，用無菌含雙抗的PBS溶液沖洗至流出液體中無可見血液。

3)夾住臍帶下端，加入15ml的膠原酶I型(1mg/ml)37℃水浴消化10-15分鐘。

4)消化完后，將下端手術鉗松開，消化液流入一個50ml無菌離心管中，用無菌含雙抗PBS溶液沖洗臍帶2-3次。

5)將收集液離心(2000轉/分)5分鐘。

6)倒去上清，加入10ml?M199培養基(含酚紅、20％新生小牛血清、2mmol/L?L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、100μg/ml血管內皮細胞生長因子-肝素)，用彎管吹散細胞，將所有液體轉入一個用明膠包被好的培養瓶中，于CO₂培養箱在37℃培養。

2.根據權利要求1所述一種人臍靜脈內皮細胞HUVEC的分離方法，其特征在于：所用臍帶為當天新生兒15-20cm長的新鮮臍帶，用無菌含雙抗的PBS溶液4℃儲存。

3.根據權利要求1所述一種人臍靜脈內皮細胞HUVEC的分離方法，其特征在于：加入15ml的膠原酶I型(1mg/ml)于37℃水浴消化10-15分鐘。

4.根據權利要求1所述一種人臍靜脈內皮細胞HUVEC的分離方法，其特征在于：所用培養基為10ml?M199培養基(含酚紅、20％新生小牛血清、2mmol/L?L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、100μg/ml血管內皮細胞生長因子-肝素)，轉入一個用明膠包被好的培養瓶中，于CO₂培養箱在37℃培養。

5.一種人臍靜脈內皮細胞HUVEC的培養與傳代方法，包括了以下步驟：

1)HUVEC細胞在CO₂培養箱37℃培養24小時后，倒掉培養基，并用無菌含雙抗的PBS溶液清洗2-3次，洗掉紅細胞和死細胞，加入10ml新鮮的M199培養基。

2)以后每2天換一次培養基，一般培養5-7天，細胞可長滿至80-90％單層，正常的內皮細胞長滿后如同卵石狀，這時可以傳代。

3)倒掉培養基，用無菌的PBS溶液清洗2-3次，加入2-3ml消化液(0.25％胰酶+0.1％EDTA)消化細胞，在顯微鏡下觀察，一旦細胞變圓，即加入2-3倍的有血清的DMEM培養基終止反應。

4)用彎管將細胞吹打下來，并將所消化的細胞轉移到一個50ml無菌離心管中，2000轉/分，離心5分鐘

5)倒掉上清，加入20ml新鮮培基，一般一瓶細胞可傳代2-3瓶。選擇傳代2-3代的HUVEC(培養了20天左右)用于實驗。

6.根據權利要求5所述一種人臍靜脈內皮細胞HUVEC的培養與傳代方法，其特征在于：HUVEC細胞于CO₂培養箱在37℃培養24小時后，用無菌雙抗PBS溶液清洗2-3次后加入10ml新鮮的M199培養基。

7.根據權利要求5所述一種人臍靜脈內皮細胞HUVEC的培養與傳代方法，其特征在于：每2天換一次培養基，一般培養5-7天，至細胞長滿至80-90％單層，進行傳代。

8.根據權利要求5所述一種人臍靜脈內皮細胞HUVEC的培養與傳代方法，其特征在于：用2-3ml消化液(0.25％胰酶+0.1％EDTA)消化細胞，在顯微鏡下觀察，一旦細胞變圓，即加入2-3倍的有血清的DMEM培養基終止反應。

9.根據權利要求5所述一種人臍靜脈內皮細胞HUVEC的培養與傳代方法，其特征在于：消化的細胞2000轉/分，離心5分鐘。

10.根據權利要求5所述一種人臍靜脈內皮細胞HUVEC的培養與傳代方法，其特征在于：選擇傳代2-3代的HUVEC(培養了20天左右)用于實驗。