[發(fā)明專(zhuān)利]基于基因組簡(jiǎn)化與二代測(cè)序DNA文庫(kù)構(gòu)建方法及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210358999.8
• 申請(qǐng)日: 2012-09-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102877136A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-01-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 潘玉春;陳強(qiáng);楊玉梅;王起山;張向喆;馬育芳;陳振亮;廖榮榮;涂盈盈;頡孝賢;王振;賀鵬飛;張哲
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C40B50/06
• 分類(lèi)號(hào): C40B50/06;C12Q1/68
• 代理公司: 上海交達(dá)專(zhuān)利事務(wù)所 31201
• 代理人: 王毓理

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的方法及試劑盒，具體是一種基于基因組簡(jiǎn)化與二代測(cè)序DNA文庫(kù)構(gòu)建方法及試劑盒。

背景技術(shù)

隨著分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、統(tǒng)計(jì)基因組學(xué)等學(xué)科的不斷發(fā)展，在基因組(Genome)層面利用全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide?association?study，GWAS)等方法研究與人類(lèi)疾病及家畜重要農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的遺傳變異成為可能，單核苷酸多態(tài)性(Single?nucleotide?polymorphism，SNP)是GWAS及許多研究工作例如基因組選擇(Genomic?selection)、高精度遺傳作圖(Highly-resolution?mapping)的基礎(chǔ)。對(duì)于位點(diǎn)較少的SNP檢測(cè)，比如少數(shù)幾個(gè)候選基因(Candidate?genes)或幾個(gè)感興趣的區(qū)域以及已知的少數(shù)靶SNP位點(diǎn)，許多方法如RT-PCR，IlluminaGoldenGate，SequenomMassARRAY，Applied?BiosysetemsSNaPshot以及Roche?LightTyper等均能實(shí)現(xiàn)小群體樣品檢測(cè)。基于微陣列SNP檢測(cè)芯片(Affymetrix，Illumina及Agilent等)的出現(xiàn)促進(jìn)群體遺傳學(xué)研究，大大提高了SNP檢測(cè)通量，使在相對(duì)較大的群體研究成為了可能，在人上發(fā)現(xiàn)了大量與復(fù)雜疾病等表型關(guān)聯(lián)的SNP，同時(shí)在重要經(jīng)濟(jì)動(dòng)物諸如豬，牛等經(jīng)濟(jì)性狀研究中發(fā)揮了重要作用。但是，相對(duì)高的檢測(cè)費(fèi)用嚴(yán)重制約了基于芯片研究的廣泛應(yīng)用，同時(shí)基于特定群體設(shè)計(jì)的微陣列芯片并不能滿(mǎn)足研究的需要，例如基于長(zhǎng)白、大白、皮特蘭和杜洛克豬設(shè)計(jì)的Illumina?porcineSNP60芯片(大約6萬(wàn)個(gè)SNP位點(diǎn))，由于中國(guó)地方豬種與西方豬種的遺傳距離較遠(yuǎn)，因此在利用該芯片研究地方豬種時(shí)存在明顯缺陷，SNP位點(diǎn)也嫌不足。跟據(jù)研究目的自定制芯片雖能滿(mǎn)足研究，但仍然存在大量的時(shí)間、勞動(dòng)力和成本消耗。

二代測(cè)序技術(shù)(Next-generation?sequencing，NGS)的出現(xiàn)革命化了群體遺傳學(xué)研究，隨著其技術(shù)不斷更新，其研究成本正不斷降低，利用二代測(cè)序技術(shù)在全基因組層面通過(guò)并行測(cè)序模式(Parallel?sequencing)以低檢測(cè)費(fèi)用發(fā)現(xiàn)數(shù)十萬(wàn)甚至百萬(wàn)SNPs成為可能，并以此發(fā)現(xiàn)了大量與復(fù)雜疾病相關(guān)以及與動(dòng)物表型相關(guān)的主效基因(Major?effect?gene)及SNP位點(diǎn)。基于二代測(cè)序個(gè)體間數(shù)據(jù)的不均一性及數(shù)據(jù)高缺失率的特點(diǎn)，測(cè)序方法的改進(jìn)即測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建(Libraries?preparation)及數(shù)據(jù)填補(bǔ)方法即基因型推演(Genotyping?imputation)是當(dāng)前研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。當(dāng)前，用于二代測(cè)序的文庫(kù)構(gòu)建方法主要有RAD-seq(Restriction-site-association?DNA?sequencing)(Baird?N.J.，et?al，2008)、WGR(Whole?genome?resequencing)(Huang?X.H.，et?al，2009)、GBS(Genotyping?by?sequencing)(Elshire?R.J.，et?al，2011)以及MSG(MμL?tiplexedshotgun?genotyping)(Andolfatto?P.，et?al，2011)等，這些方法已分別成功運(yùn)用到棘魚(yú)(Stickleback)、水稻(Rice)、大麥(Barley)和玉米(Maize)以及果蠅(Fruit?fly)等物種的SNP發(fā)現(xiàn)(SNP?discovery)及基因分型(Genotyping)研究。由于這些物種均為“小”基因組(Small?genome)和重組近交系(Recombinant?inbred?lines)群體，且有較高質(zhì)量的參考序列(Reference?panel)，因此，在較低測(cè)序深度(Sequencing?depth)和覆蓋度Coverage)時(shí)能夠通過(guò)直接分型(Directly?genotyping)和間接分型(Imputating?genotyping)發(fā)現(xiàn)大量的標(biāo)記。然而，對(duì)于來(lái)源于遠(yuǎn)交群體(Outbreeding?popμLation)的二倍體雜合物種，特別是系譜不清晰、低質(zhì)量參考序列以及無(wú)單體型圖的物種，比如豬，這些方法并不完全適合用。

發(fā)明內(nèi)容