[發(fā)明專利]一種蠅類腸道微生物總DNA的提取方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210357802.9
• 申請日: 2012-09-24
• 公開（公告）號: CN102827833A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發(fā)明（設計）人: 劉楊;樊學軍;楊雨;鐘瑋;田綠波;趙鋒
• 申請（專利權(quán)）人: 四川國際旅行衛(wèi)生保健中心
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 成都信博專利代理有限責任公司 51200
• 代理人: 卓仲陽

技術(shù)領域

本發(fā)明涉及分子生物學實驗室技術(shù)，尤其是一種經(jīng)過改進的蠅類腸道微生物總DNA的提取方法。

背景技術(shù)

蠅類是一種與人類生活關系密切的昆蟲，由于獨特的生活習性，其與許多動物和人類疾病的傳播有關，已被世界衛(wèi)生組織確定為媒介生物。蠅類由于長期生活在衛(wèi)生條件惡劣的地區(qū)，其體內(nèi)存在獨特的微生物群落，這些微生物群落不僅在蠅類的營養(yǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用，而且其中大量的致病菌還不斷激發(fā)蠅類的自然免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生抑菌肽。因此對蠅類腸道微生物群落的研究不僅能發(fā)現(xiàn)新的微生物種類、揭示疾病傳播的規(guī)律，還能研究致病菌與動物自然免疫系統(tǒng)之間的協(xié)同進化關系，研究和分離天然抑菌肽。

傳統(tǒng)方法在研究自然環(huán)境中的微生物時，首先需要對微生物進行純化培養(yǎng)，不僅費時費力，而且目前的實驗技術(shù)只能對自然界中約1%的微生物進行純化培養(yǎng)，剩余99%的微生物由于不能在實驗室培養(yǎng)，研究比較困難。現(xiàn)代分子生物學技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)、基因組測序和宏基因組方法的推廣應用，為研究自然界微生物群落結(jié)構(gòu)提供了有利工具。采用分子生物學方法研究環(huán)境微生物群落，首先需要從環(huán)境樣本中提取到微生物的總DNA，環(huán)境樣本種類繁多、成分復雜、干擾物質(zhì)可能對下游操作產(chǎn)生影響。因此，建立高效、快速的微生物總DNA提取方法是進行環(huán)境樣本微生物群落研究的前提。

蠅類腸道微生物總DNA提取的主要目標是獲得高質(zhì)量的總DNA，確保DNA?的完整性和代表性，以利于進一步建立有代表性的16S?rRNA文庫。但來自蠅類腸道的樣品成分非常復雜，尤其是脂類、酸類等有機物質(zhì)在總DNA提取過程中很難去除，直接影響后續(xù)的PCR擴增、酶切反應的效果。此外，微量的蠅類腸道樣本，經(jīng)過細胞裂解、DNA純化等多個步驟以后，得率大大降低，最終得到的總DNA濃度往往不能滿足下一步分子操作的需要。目前大部分總DNA提取方法都存在缺陷，如細胞裂解不完全、DNA提取物中含有酶抑制劑以及DNA的丟失、降解和剪切等問題。

因此為了解決常規(guī)方法獲得的DNA樣品存在酶反應抑制物、細胞裂解率低、DNA損失嚴重等問題，需要研究適用于蠅類腸道微生物總DNA提取的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種適用于蠅類腸道微生物總DNA提取的方法，以克服常規(guī)方法獲得DNA樣品存在酶反應抑制物、細胞裂解率低、DNA損失嚴重方面的缺陷。

本發(fā)明之目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：一種蠅類腸道微生物總DNA的提取方法，包括如下步驟：

（1）在一個滅菌的3cm培養(yǎng)皿中加入1mLSTE緩沖液，取出蠅類的中腸，在STE中懸浮，去除多余的組織，用鑷子將中腸夾碎,獲得中腸懸浮液；

（2）將由上述步驟（1）獲得的中腸懸浮液轉(zhuǎn)移到一個無菌1.5mL離心管中，渦旋震蕩1min，200rmp離心2min，將獲得的上層液體轉(zhuǎn)移到一個新的無菌1.5mL第二離心管中；

（3）再在原有的無菌1.5mL離心管的沉淀中加入0.5mLSTE緩沖液，2～3次重復步驟（2），并將離心后獲得的上層液體合并；

（4）將上述步驟（3）中合并的上層液體置于新的無菌1.5mL第三離心管中，5000～8000rpm離心2min，直至形成致密的沉淀，吸取并丟棄上層液體，用200μLSTE緩沖液將第三離心管底的沉淀重懸；

（5）將上述步驟（4）中獲得的沉淀液中加入溶菌酶，使沉淀液中的酶濃度達到4mg/mL，充分混勻，于37℃溫度培育1hr；

（6）再加入20μL?10%的SDS和1μL?50mg/mL蛋白酶K，充分混勻，55℃溫度培育18～24hr；

（7）再加入2.5μL?10mg/mL?RNA酶A，充分混勻，37℃溫度培育1h；

（8）再加入等體積的配比比例為24:1的氯仿:異戊醇(24:1)，充分混勻，12000rmp離心5min；將上清液轉(zhuǎn)入一個新的第四離心管中；

（9）將上述步驟（8）中獲得的上清液加入等體積的配比比例為25:24:1的酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，充分抽提，12000rmp離心5min，獲取上清液轉(zhuǎn)入新的第五離心管中；

（10）將上述步驟（9）中獲得的上清液加入0.6倍體積的異丙醇，顛倒混合直到白色纖維狀DNA沉淀形成；12000rmp離心5min，丟棄上清液，加入70%乙醇離心洗滌2次；

（11）將上述步驟（10）中獲得的沉淀物，在室溫下充分干燥后，用50μL的TE緩沖液溶解沉淀物，獲得DNA分子；