[發明專利]一種檢測H4N6型禽流感病毒的試劑盒

無效

• 申請號: 201210357469.1
• 申請日: 2012-09-24
• 公開（公告）號: CN102876806A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 天津朝?？萍加邢薰?/a>
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種用納米金顆粒檢測H4N6型禽流感病毒DNA或RNA經環介導等溫核酸擴增技術擴增后產物DNA的試劑盒，屬于生物檢測技術領域。

背景技術

對基因（DNA）及其轉錄產物（RNA）的高靈敏性、高特異性、簡單、快速的檢測，對于疾病的早期診斷和治療以及在在衛生防疫、環境監測、檢驗檢疫等領域都具有十分重要的意義。以往在這方面較為準確靈敏的檢測方法有熒光標記法、放射性標記等方法，這些方法都需要復雜的操作和特殊的設備，應用范圍很窄。1993年PE公司的Dr.?Kary?B.?Mullis發明了聚合酶鏈式反應(Polymerase?Chain?Reaction)，簡稱PCR。隨后PCR技術大規模的應用于生物科研和臨床治療中，對DNA的檢測進入了新的時代，Dr.?Mullis為此還獲得了1993年的諾貝爾化學獎。雖然PCR方法具有快速、靈敏、準確性高、操作較簡單等優點，但由于其反應進行和產品DNA的檢測需要特殊的儀器，PCR技術的使用一直被限定在專業的實驗室和醫院里。

2001年日本榮研化學株式會社研制出了一種新型DNA擴增方式，環介導等溫核酸擴增技術（LAMP）可以在恒溫條件下實現DNA的高效快速擴增，該方法反應條件簡單，DNA擴增效率高，因此在核酸檢測方面具有明顯優勢。但是對LAMP擴增制備的DNA產物使用常規的檢測方法，如電泳法，熒光染料法等，均無法排除LAMP擴增所帶來的假陽性問題，而且需要特殊的儀器，因此限制了LAMP技術的實際應用。

禽流感，全名鳥禽類流行性感冒，是由病毒引起的動物傳染病，通常只感染鳥類，少見情況會感染豬。禽流感病毒高度針對特定物種，但在罕有情況下會跨越物種障礙感染人。自從1997年在香港發現人類也會感染禽流感之后，此病癥引起全世界衛生組織的高度關注。其后，本病一直在亞洲區零星爆發，但在2003年12月開始，禽流感在東亞多國──主要在越南、韓國、泰國──嚴重爆發，并造成越南多名病人喪生。直到2005年中，疫癥不但未有平息的跡象，而且還不斷擴散。現時遠至東歐多個國家亦有案例。

根據核蛋白的抗原性分類，禽流感病毒則屬甲型流感病毒，甲型流感病毒是根據位于其套膜上的血凝素及神經氨酸酶的抗原性分為若干亞型，血凝素（H）有16個亞型；神經氨酸酶（N）有9個亞型。所有的這些亞型都可以感染鳥，在禽類中高致病性的屬于H5、H7亞型。典型的雞禽流感病毒是H7N7，造成1983年、1984年在美國東部大流行的是H5N2。目前東南亞地區出現的人類感染是H5N1型。1997年發現的H5N1型毒株被認定是當時流行性感冒的病源。1999年，香港出現過H9N2型禽流感的人類感染，2003年，荷蘭出現過H7N7型禽流感的人類感染；2006年1月，美國出現H3N2。

H4N6型禽流感病毒的對人類的生活影響很大，但是目前針對H4N6型禽流感病毒缺乏簡單、快速、便于使用和成本低廉的檢測方法。

發明內容

本發明的目的是提出一種用納米金顆粒檢測H4N6型禽流感病毒專有的基因片段經環介導等溫核酸擴增技術擴增后產物DNA的試劑盒，從而判定H4N6型禽流感病毒的存在與否。

本發明采用如下采用下述技術方案來解決上述問題：本發明試劑盒包括兩部分：（1）標記有可以識別H4N6型禽流感病毒特定序列的分子探針的納米金顆粒；（2）可以擴增待檢測樣品中的H4N6型禽流感病毒DNA或先經過逆轉錄過程后再擴增待檢測樣品中的H4N6型禽流感病毒RNA的環介導等溫核酸擴增體系。

本發明中，試劑盒的工作原理為：1．納米金顆粒標記有能識別H4N6型禽流感病毒特定序列的分子探針，分子探針被固定在納米金顆粒的表面。

2．待檢測樣品中的H4N6型禽流感病毒DNA分子或H4N6型禽流感病毒RNA經環介導等溫核酸擴增技術大量復制或先經逆轉錄過程后大量復制，H4N6型禽流感病毒的目標片段被放大109倍，產生的擴增產物DNA具有多重重復序列。

3．混合納米金顆粒和環介導等溫核酸擴增體系，H4N6型禽流感病毒經環介導等溫核酸擴增技術以后的產物DNA與納米金顆粒上能識別H4N6型禽流感病毒特定序列的分子探針雜交。

4．納米金顆粒沿環介導等溫核酸擴增技術產物DNA分子鏈形成聚集體（如附圖所示），進而引發納米金顆粒聚集處（例如溶液中、固體表面等）的顏色變化，依據顏色變化可以判斷待測樣品是否具有H4N6型禽流感病毒DNA或RNA。

本發明中，納米金顆粒探針包括兩個部分，一是納米尺度的金顆粒，另一部分是固定在納米金顆粒表面的分子探針，該探針可以識別H4N6型禽流感病毒的特定序列。