[發(fā)明專利]利用LAMP檢測(cè)溶藻弧菌的引物組及其快速診斷試劑盒

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210357421.0
• 申請(qǐng)日: 2012-09-24
• 公開（公告）號(hào): CN102851385A
• 公開（公告）日: 2013-01-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐義剛;吳巖;李丹丹;劉忠梅;劉新亮;李蘇龍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用LAMP檢測(cè)溶藻弧菌的引物組及其快速診斷試劑盒。

背景技術(shù)

溶藻弧菌（Vibrio?alginolyticus）是一種嗜鹽性革蘭氏陰性細(xì)菌，廣泛分布于河口和海洋環(huán)境中，是引起魚、蝦、貝等多種海水養(yǎng)殖動(dòng)物致病和死亡的主要致病性弧菌，可引起傷口感染、胃腸炎和敗血癥等癥狀，嚴(yán)重威脅著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大。近年來(lái)，由于溶藻弧菌引起食物中毒事件的不斷出現(xiàn)，使人們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到了溶藻弧菌對(duì)人類的致病性和危害，也因此將其列入食源性致病菌的范疇，成為食品衛(wèi)生日常監(jiān)測(cè)和檢疫對(duì)象。??

目前，我國(guó)針對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖中溶藻弧菌等細(xì)菌性致病菌的預(yù)防缺乏有效的措施，主要依賴于抗生素的廣泛使用，導(dǎo)致了耐藥菌株的出現(xiàn)，同時(shí)也對(duì)人類的健康構(gòu)成威脅。此外，檢測(cè)手段滯后，仍以傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、生物化學(xué)反應(yīng)鑒定為主，雖然檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，但是實(shí)驗(yàn)操作較繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，一般需要5-7d完成檢測(cè)，影響檢測(cè)時(shí)限。因此，發(fā)展操作簡(jiǎn)便、快速準(zhǔn)確、靈敏度高且易推廣的檢測(cè)方法，對(duì)溶藻弧菌進(jìn)行早診斷和早預(yù)防，提高食品衛(wèi)生水平，保證食品安全具有重要意義。

LAMP技術(shù)是具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ囊环N高新檢測(cè)技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，已在疾病診斷、物種鑒定等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。該方法的技術(shù)特點(diǎn)是依賴于能夠特異性識(shí)別靶基因上6個(gè)特定區(qū)域的4條引物，利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶，60-65℃恒溫條件下，40-60min內(nèi)即可完成檢測(cè)工作，伴隨目標(biāo)DNA的不斷擴(kuò)增，產(chǎn)生大量的LAMP副產(chǎn)物-焦磷酸鎂白色沉淀，使反應(yīng)溶液變渾濁，并以此作為直接的結(jié)果判斷依據(jù)。

溶藻弧菌主要有6個(gè)毒力相關(guān)基因，即鐵調(diào)蛋白基因（fur）、鞭毛蛋白基因（flaA）、膠原酶基因（valC）、堿性絲氨酸蛋白酶基因（aspA）、外膜蛋白基因（ompK和OmpW）。根據(jù)靶基因種內(nèi)高度保守、種間高度特異的選擇原則，經(jīng)過序列BLAST比對(duì)分析，溶藻弧菌的膠原酶基因是作為檢測(cè)靶基因的理想候選者。本發(fā)明選取了溶藻弧菌膠原酶基因作為靶基因，根據(jù)其保守區(qū)設(shè)定合成了4條LAMP反應(yīng)專用引物，建立了溶藻弧菌的LAMP檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)成本低的一種檢測(cè)溶藻弧菌的LAMP引物組及其快速診斷試劑盒。本發(fā)明利用Genbank中已發(fā)布的溶藻弧菌基因組DNA序列，結(jié)合生物信息學(xué)手段，確定以溶藻弧菌膠原酶（collagenase）基因保守區(qū)序列作為檢測(cè)靶序列，設(shè)計(jì)合成了4條特異性的LAMP引物，對(duì)溶藻弧菌進(jìn)行定性檢測(cè)。?

本發(fā)明采用以下主要技術(shù)特征：

一種利用LAMP檢測(cè)溶藻弧菌的引物組，由外引物對(duì)和內(nèi)引物對(duì)組成，

所述的外引物對(duì)為：

F3：?CCAGTGGCTTACTCGTTGG，

B3：?TTCGCGGCCATAAACTCAT，

所述的內(nèi)引物對(duì)為：

FIP：?CGTTCCACTGCCCACCAAACAAGCCCAGCACTGGTATATGC，

BIP：?GGCAACCAAACGGACCTTGCCCGATTGATGACGCCCTTAG。

本發(fā)明還具有如下特點(diǎn)：

一種利用LAMP檢測(cè)溶藻弧菌的快速診斷試劑盒，它含有如上所述的引物組、陽(yáng)性對(duì)照品、LAMP反應(yīng)液和Bst?DNA?Polymerase聚合酶。

所述的引物中外引物對(duì)和內(nèi)引物對(duì)的添加摩爾比為1:4。

所述的溶藻弧菌包括對(duì)溶藻弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和溶藻弧菌分離菌株進(jìn)行檢測(cè)；

所述的LAMP反應(yīng)體系為：

LAMP反應(yīng)條件：65℃水浴作用45min。采用瓊脂糖凝膠電泳法或濁度觀察法進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果的判定。

利用試劑盒法提取溶藻弧菌基因組DNA，以提取的溶藻弧菌基因組DNA作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)陽(yáng)性模板。采用單因子濃度梯度實(shí)驗(yàn)法逐一改變LAMP反應(yīng)體系中各組分濃度，以優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系，并調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度和作用時(shí)間，建立了LAMP檢測(cè)方法（見圖1）。