[發(fā)明專利]豬肉及其制品中弓形蟲RT-LAMP快速檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210357402.8
• 申請日: 2012-09-24
• 公開（公告）號: CN102899410A
• 公開（公告）日: 2013-01-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曲道峰;韓劍眾;陶斯悅;鄭柏玲;蘇春雷;杜愛芳;池娜
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工商大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 杜軍

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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種快速檢測肉制品中弓形蟲(T.?gondii)?的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(Reverse?Transcription?Loop-Mediated?Isothermal?Amplification，RT-LAMP)檢測方法，具體涉及一種豬肉及其制品中弓形蟲RT-LAMP快速檢測方法。

背景技術(shù)

弓形蟲?。╰oxoplasmosis）由剛地弓形蟲（Toxoplasma?gondii）引起的一種人畜共患病，弓形蟲病不僅給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失，還嚴重威脅著人類的食品衛(wèi)生安全和人類健康。豬肉是人們生活中最主要的動物性食品來源，人群可通過攜帶弓形蟲的豬肉、肝臟等動物源性產(chǎn)品而感染，豬弓形蟲病的高發(fā)嚴重威脅著人類健康，對公共食品安全造成極大危害，目前，弓形蟲的檢測主要依靠血清學、病原形態(tài)鑒定等傳統(tǒng)方法，然而，這些檢測方法都有不足之處，如：檢測時間長，檢測程序繁瑣，工作量大，很難適應(yīng)現(xiàn)代化食品安全快速檢測的需要，嚴格的病原體檢測是保障食品安全的重要環(huán)節(jié)，因此亟需建立一種操作簡便、快速準確、靈敏度和特異性都較高的現(xiàn)代化檢測弓形蟲方法。

逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(Reverse?Transcription?Loop-Mediated?Isothermal?Amplification，RT-LAMP)特點是針對靶基因的8個區(qū)域設(shè)計6種特異性引物，利用鏈置換DNA聚合酶（Bst?DNA?polymerase）在大約65℃恒溫條件下保溫1小時左右即可完成核酸擴增反應(yīng)，通過直接觀察擴增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀的濁度即可判斷擴增反應(yīng)是否進行，具有高特異性、高效性、快速、簡便、易檢測等特點。弓形蟲核糖體RNA（18sRNA）具有很好的種屬特異性，而且18sRNA占細胞RNA總數(shù)的80%以上，以弓形蟲18sRNA為目的基金診斷肉制品中弓形蟲可以提高檢測方法的特異性及敏感性，基于18sRNA的優(yōu)異性，結(jié)合RT-LAMP的快速、簡便等優(yōu)點，建立以18sRNA為目的基因的RT-LAMP快速檢測方法，從而為肉制品的安全檢測提供有效的手段和研究工具，為動物源性食品安全的監(jiān)控及政府決策提供系統(tǒng)、科學的資料與依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種豬肉及其制品中弓形蟲RT-LAMP快速檢測方法。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下：?

步驟(1).樣品前處理

豬肉及其制品取樣25g，加入10倍豬肉及其制品體積的滅菌蒸餾水中，用組織勻漿機均質(zhì)1?min，制成組織勻漿樣品；

步驟(2).弓形蟲RNA提取

取組織勻漿樣品轉(zhuǎn)移到離心管后，加入Trizol試劑，其中組織勻漿樣品與Trizol試劑的體積含量比為1:10，常溫靜置5min；在轉(zhuǎn)速12000rpm，溫度為4?℃條件下離心5?min，取上清液至新的離心管中，加入200?μl氯仿，蓋上離心管蓋，充分混合至溶液呈乳白狀后，常溫靜置5min；在轉(zhuǎn)速12000rpm，溫度為4?℃條件下離心10?min，取上清液至新的離心管中，加入與該上清液等體積的異丙醇，充分混合后，常溫靜置10?min；在轉(zhuǎn)速12000rpm，溫度為4?℃條件下離心10?min，棄掉上清液，加入1?ml?體積含量為75%的乙醇洗滌離心管壁，在轉(zhuǎn)速12000?rpm，溫度為4?℃條件下離心10?min后，取沉淀物；常溫下干燥沉淀物5min，加入20?μl?RNase-free水溶解沉淀物，得到RNA提取物；

將RNA提取物采用核酸蛋白檢測儀測定模板DNA的濃度與純度；

步驟(3).RT-LAMP擴增

將RT-LAMP擴增反應(yīng)體系振蕩混勻后，置于65℃水浴鍋中反應(yīng)1?h后，置于80℃水浴鍋中2?min滅活Bst?DNA聚合酶，得到擴增產(chǎn)物；