[發明專利]一種長片段末端文庫的構建方法

無效

• 申請號: 201210357019.2
• 申請日: 2012-09-24
• 公開（公告）號: CN102864498A
• 公開（公告）日: 2013-01-09
• 發明（設計）人: 陳祖耕;姜楠;王萍;暴云娟;劉桂友;陳曉云
• 申請（專利權）人: 天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C40B40/06
• 分類號: C40B40/06;C40B50/06;C12Q1/68
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

1.一種長片段末端文庫的構建方法，其特征在于，所述的方法的步驟如下：

1）首先將基因組DNA隨機打斷，并將打斷的DNA進行末端缺口補齊修復；

2）將修復的DNA片段的3′端加上脫氧腺苷酸A，制成A-Fragment；

3）將制成A-Fragment與3′端帶有突出的脫氧胸甘酸T的?LMP?Adaptor進行粘性末端的連接，獲得環狀的LMP-Adaptor-Fragment；

4）將去除了未環化的線性分子的LMP-Adaptor-Fragment用不少于兩種的識別四個堿基的限制性內切酶消化adaptor以外的區域，獲得相應的酶消化文庫；???

5）將步驟4）獲得的酶消化文庫中的片段進行末端缺口補齊修復后，按照步驟3）再次進行環化；

6）將步驟5）獲得的環化產物用核酸外切酶消化去除未環化的線性分子；用純化后的環狀分子作為模版，LMP?Adaptor的引物進行擴增，擴增產物回收后完成長片段末端文庫的構建。

2.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于所述的步驟1）將打斷的DNA進行末端缺口補齊修復是用T4?DNA?polymerase來進行的。

3.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于所述的步驟4）中所述的識別四個堿基的限制性內切酶為Hha?I、Nla?III、Hpa?II、Mse?I或MluC?I。

4.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于所述的步驟6）中的LMP?Adaptor的引物的序列為SEQ?ID?NO:1和2。