[發明專利]一種MTHFRD基因多態性C677T的檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201210356878.X
• 申請日: 2012-09-21
• 公開（公告）號: CN103205484A
• 公開（公告）日: 2013-07-17
• 發明（設計）人: 王順旺;王小波;許文勇;葉水龍
• 申請（專利權）人: 廈門市第三醫院;王順旺
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司 35204
• 代理人: 張松亭

技術領域

本發明屬于體外核酸檢測領域，涉及采用基于熒光能量傳遞技術(fluorescence?resonance?energy?transfer,FRET)的實時熒光PCR技術檢測MTHFR基因多態性(C677T)的方法及試劑盒。

背景技術

葉酸是由喋呤啶、對氨基苯甲酸和谷氨酸等組成的化合物，是一種水溶性B族維生素。葉酸對人體的重要營養作用早在1948年即已得到證實。葉酸是人體在利用糖分和氨基酸時的必要物質，是機體細胞生長和繁殖所必需的物質。葉酸在制造核酸（核糖核酸、脫氧核糖核酸）上扮演重要的角色。葉酸幫助蛋白質的代謝，并與維生素B12共同促進紅細胞的生成和成熟，是制造紅血球不可缺少的物質。葉酸對細胞的分裂生長及核酸、氨基酸、蛋白質的合成起著重要的作用。人類（或其他動物）如缺乏葉酸可引起巨紅細胞性貧血以及白細胞減少癥，還會導致身體無力、易怒、沒胃口以及精神病癥狀。此外，研究還發現，葉酸對孕婦尤其重要。如在懷孕頭3個月內缺乏葉酸，可導致胎兒神經管發育缺陷，從而增加裂腦兒，無腦兒的發生率。其次，孕婦經常補充葉酸，可防止新生兒體重過輕、早產以及嬰兒腭裂（兔唇）等先天性畸形。但是適應物極必反的原則，葉酸也不能濫補，長期服用葉酸會干擾孕媽媽的鋅代謝，鋅一旦攝入不足，就會影響胎兒的發育。

人類基因組DNA中5,10亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是葉酸代謝系統中的關鍵酶，能催化5，10亞甲基四氫葉酸轉變為5-甲基四氫葉酸，而后者為同型半胱氨酸轉化為蛋氨酸的甲基供體。MTHFR基因677位單核苷酸多態性(C677T)導致第222位丙氨酸被纈氨酸替代，影響酶的催化結構域，形成熱不穩定的蛋白質，酶活性降低約70%。從而引起葉酸代謝障礙，引發多種疾病，其中以高同型半胱氨酸血癥引起的腦卒中以及新生兒缺陷最為嚴重。檢測MTHFR基因型，可以提示腦卒中風險性，同時還能指導孕婦服用葉酸，降低唐氏綜合征、唇腭裂、神經管缺陷等新生兒缺陷。在中國人中，高達17%-47%的人為MTHFR基因異常人群。

MTHFR基因正常的人，攝入的葉酸能夠在體內順利代謝，降低高同型半胱氨酸的水平。這類人腦中風、冠心病和靜脈血栓的發病風險較低。MTHFR基因異常的人，攝入的葉酸在體內的代謝途徑受阻，可能引起高同型半胱氨酸血癥，導致凝血傾向增高，因此發生腦中風、冠心病以及靜脈血栓的風險也增高。

我國推薦孕期補充量為400微克/天，對于：MTHFR基因正常的人，攝取推薦量的葉酸，能夠顯著降低患兒的出生缺陷率。MTHFR基因異常的人，MTHFR酶活性明顯降低，對葉酸代謝造成障礙，導致新生兒神經管缺陷、唐氏綜合癥及唇腭裂等疾病的發病風險明顯增高。對于這類人需要補充更多的葉酸才能達到預期的效果。所以對MTHFR基因的檢測在臨床意義上具有重大的作用。

目前MTHFR基因多態性(C677T)檢測方法有以下幾種：首先是作為“金標準”的基因測序，具有較高的特異性，并且能夠大通量地檢測，但是因為測序儀器很昂貴，沒有辦法普及，如果通過第三方服務來進行檢測，則需要較高的時間成本，標本的保存與運輸也是一種挑戰。基于分子水平，迄今國內外報道對MTHFR基因的檢測方法大都是采用PCR-RFLP，此方法以來限制性內切酶消化，電泳分析，酶切不完全往往被誤判為雜合子，因為PCR產物要進行開管操作，容易形成氣溶膠，導致假陽性的產生。電泳分析需要制備聚丙烯酰胺凝膠，EB染色，費時費力，并且有化學性危害。日前有采用MGB探針的方法，此方法能夠避免開蓋污染，具有較強的特異性，但是MGB探針的合成要求較高，國內只有數家公司可以合成，并且價格昂貴不適合常規的檢查。

發明內容

本發明的目的即在于克服背景技術的以上缺陷，提供一種PCR-FRET法的檢測試劑盒，以對MTHFR基因多態性(C677T)進行檢測。

本發明的技術方案如下：

一種MTHFRD基因多態性C677T的檢測試劑盒，包括如下的引物對：

MTHFR-F：5’-TCATCCCTCGCCTTGAACAG-3’

MTHFR-R：5’-CTCAGCGAACTCAGCACTCC-3’