[發明專利]一種對甲胎蛋白檢測的磁性分離體外夾心免疫分析方法

無效

• 申請號: 201210353216.7
• 申請日: 2012-09-11
• 公開（公告）號: CN102879582A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 干寧;周漢坤;李天華;曾少林;周靖;熊萍;杜曉雯
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/76
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及到甲胎蛋白的檢測分析，是基于一種體外夾心的免疫分析方法結合磁性納米粒子分離技術通過電致化學發光分析方法進行定量分析，構建一個高靈敏度，高選擇性的磁性分離電致化學發光免疫傳感器，實現對甲胎蛋白的檢測。

背景技術

甲胎蛋白是肝癌的特異性標志物，診斷原發性肝癌，檢測甲胎蛋白的含量是其重要的手段之一。正常人體內甲胎蛋白含量偏高會可能與慢性肝炎，先天性膽管閉塞，畸形胎兒，生殖細胞腫瘤這些疾病相關，因此早期篩查，早期診斷是非常有必要的在預防其可能造成的負面影響。

目前，對甲胎蛋白的檢測主要有以下分析方法：聯酶免疫分析，放射性免疫分析，熒光免疫分析，化學發光免疫分析等。但是上述的一些儀器分析方法操作復雜，依賴大型昂貴的儀器，且樣品前處理過程繁瑣，耗時長，儀器的操作需要專業技術人員進行。化學發光免疫分析隨雖儀器設備要求簡單，測定線性范圍寬的特點，但是無法克服其選擇性差，對樣品檢測不靈敏的缺陷。

當前對腫瘤標志物的檢測要求逐步提高，因此建立一種高靈敏，快速，前處理操作簡單且干擾小的分析檢測方法，為檢測甲胎蛋白成為一種迫切的需要。電致化學發光免疫分析基于此種需要逐漸被公眾所接受。電致化學發光(Electrochemiluminescence，ECL)是在化學發光基礎上發展起來的一種新的檢測技術，通過電極對含有化學發光物質的體系施加一定的電壓或者電流，使發光物質受激發并躍遷回基態而發出光子，因此電化學發光具有電化學優良的選擇性和化學發光的高靈敏度的優點。基于以上所述電致化學發光優良性質，構建電致化學發光免疫傳感器，建立相關電致化學發光免疫分析方法應用到實際分析檢測。

磁性納米粒子既具有納米材料的特性同時兼具有磁性響應，在蛋白質分離方面得到廣泛應用，大大簡化了樣品的前處理過程。經過改性的磁性納米粒子，表面帶有大量SH-，NH₂-等功能基團，易于與其他物質偶聯作用，應用到樣品分離中。

本發明在磁性納米粒子表面形成納米金殼層，通過納米金對抗體的固定，在試管內進行夾心免疫反應，磁性分離，篩選出標記有信號標簽的夾心免疫復合物，極大的簡化了免疫夾心復合物的分離過程，信號標簽的信號擴增作用進一步提高了其檢測的靈敏度，為檢測血清中AFP提供一個高靈敏度，高選擇性，快速分離的分析檢測方法。

發明內容

本發明的目的在于構建一種高靈敏度，簡單快速，高選項性的檢測血清中甲胎蛋白的免疫傳感器。

本發明所要解決的問題是，傳統的構建免疫傳感器一般是通過層層組裝的過程，耗時長，而且在構建過程中容易受到外部條件的干擾，導致傳感器在檢測某一目標物質時重現性差，信號不穩定。通過磁性納米粒子固定抗體與抗原和信號標簽形成夾心免疫復合物，基于磁性的分離技術簡化傳感器構建過程，通過電致化學發光免疫分析實現對甲胎蛋白的檢測。

本發明通過以下技術方案實現：

一種結合磁性分離的體外夾心免疫傳感器的構建包括基底電極，其特征在于所述的基底電極是在電極表面修飾了通過磁性分離篩選的帶有信號標簽的夾心免疫復合物。帶有信號標簽的夾心免疫復合物的構建包括，捕獲探針，其特征在于磁性納米粒子對甲胎蛋白抗體的固定(一抗)，形成捕獲探針，然后通過抗體/抗原之間的鍵合作用，將甲胎蛋白抗原結合到磁性納米粒子固定的一抗上面。信號標簽，其特征是通過信號物質(量子點)與甲胎蛋白抗體結合(二抗)，在二抗上面標記有量子點的信號標簽。將已經捕獲的甲胎蛋白抗原的捕獲探針與信號標簽一起溫育構建形成捕獲探針-抗原-信號標簽夾心免疫復合物。

所述的基底電極為玻碳電極。

本發明提供的一種結合磁性分離的體外夾心免疫傳感器對甲胎蛋白的特異性分析檢測，其技術方案如下：

(1)具有磁性的捕獲探針的制備：稱取20mg磁性納米Fe₃O₄-Au超聲分散15～20min在pH為7.4的PBS緩沖溶液中，制備成均勻分散的1mg?mL^-1Fe₃O₄-Au/PBS分散液。吸取1mL與50μg?mL^-1的甲胎蛋白抗體(Ab1)，在4℃的溫度下混合攪拌24h，加入1mL1％牛血清蛋白(BSA)封閉其他未結合抗體的活性位點。磁性分離洗滌未被磁性納米Fe₃O₄-Au固定的Ab1，洗滌過后重新分散在1mL?pH7.4的PBS溶液中。得到具有磁性的捕獲探針(Fe₃O₄-Au/Ab1)；