[發明專利]一種鼠源抗人大腸癌Fab噬菌體抗體庫及其構建方法

無效

• 申請號: 201210352439.1
• 申請日: 2012-09-21
• 公開（公告）號: CN102888658A
• 公開（公告）日: 2013-01-23
• 發明（設計）人: 張學梅;梁文波;曹陽;張海玉;王清
• 申請（專利權）人: 大連大學
• 主分類號: C40B40/10
• 分類號: C40B40/10;C12N15/13;C12N15/63;C07K16/30
• 代理公司: 大連智慧專利事務所 21215
• 代理人: 周志艦

1.一種鼠源抗人大腸癌Fab噬菌體抗體庫，其特征在于：

(1)取多藥耐藥性大腸癌病理組織，勻漿后免疫小鼠，抗體滴度大于1:512，提取總RNA并逆轉錄為cDNA；

(2)設計17條重鏈上游引物，見SEQ?ID?NO：1-17和5條重鏈下游引物，見SEQ?ID?NO：18-22及20條輕鏈上游引物，見SEQ?ID?NO：,23-42及2條輕鏈下游引物見SEQ?ID?NO：43,44，其中重鏈5′引物引入XhoⅠ酶切位點，3′引物引入SpeⅠ酶切位點，輕鏈5′引物引入SacⅠ酶切位點，3′引物引入XbaⅠ酶切位點；

(3)PCR擴增小鼠IgG重鏈及輕鏈基因片段；

(4)重鏈Fd庫的建立：將載體pComb3質粒與重鏈Fd段擴增產物分別進行XhoⅠ、SpeⅠ雙酶切后連接，連接產物熱激轉化XL1-blue感受態細胞，得重鏈Fd庫，多次轉化后使Fd庫的克隆數達到10⁵以上，并提取重鏈Fd-pComb3庫質粒；

(5)輕鏈T-L庫的建立：將輕鏈擴增產物與T載體連接，將連接產物熱激轉化TOP10感受態細胞，得到輕鏈T-L庫，多次轉化后使T-L克隆數達到10⁵以上，并提取輕鏈T-L庫質粒；

(6)抗體庫的建立：將重鏈Fd-pComb3庫質粒與輕鏈T-L庫質粒分別進行XbaⅠ、SacⅠ雙酶切，凝膠回收，將Fd-pComb3與L連接，連接產物熱激轉化至XL1-blue感受態細胞，多次轉化后得到Fab抗體庫，?Fab抗體庫容量達到10⁶克隆以上。

2.一種鼠源抗人大腸癌Fab噬菌體抗體庫的構建方法，其特征在于：

(1)取多藥耐藥性大腸癌病理組織，勻漿后免疫小鼠，抗體滴度大于1:512，提取總RNA并逆轉錄為cDNA；

(2)?設計17條重鏈上游引物，見SEQ?ID?NO：1-17和5條重鏈下游引物，見SEQ?ID?NO：18-22及20條輕鏈上游引物，見SEQ?ID?NO：,23-42及2條輕鏈下游引物見SEQ?ID?NO：43,44，其中重鏈5′引物引入XhoⅠ酶切位點，3′引物引入SpeⅠ酶切位點，輕鏈5′引物引入SacⅠ酶切位點，3′引物引入XbaⅠ酶切位點；

(3)PCR擴增小鼠IgG重鏈及輕鏈基因片段；

(4)重鏈Fd庫的建立：將載體pComb3質粒與重鏈Fd段擴增產物分別進行XhoⅠ、SpeⅠ雙酶切后連接，連接產物熱激轉化XL1-blue感受態細胞，得重鏈Fd庫，多次轉化后使Fd庫的克隆數達到10⁵以上，并提取重鏈Fd-pComb3庫質粒；

(5)輕鏈T-L庫的建立：將輕鏈擴增產物與T載體連接，將連接產物熱激轉化TOP10感受態細胞，得到輕鏈T-L庫，多次轉化后使T-L克隆數達到10⁵以上，并提取輕鏈T-L庫質粒；

(6)抗體庫的建立：將重鏈Fd-pComb3庫質粒與輕鏈T-L庫質粒分別進行XbaⅠ、SacⅠ雙酶切，凝膠回收，將Fd-pComb3與L連接，連接產物熱激轉化至XL1-blue感受態細胞，多次轉化后得到Fab抗體庫，?Fab抗體庫容量達到10⁶克隆以上。