[發明專利]一種格特隱球菌及其分離培養方法與應用

無效

• 申請號: 201210351852.6
• 申請日: 2012-09-19
• 公開（公告）號: CN102876585A
• 公開（公告）日: 2013-01-16
• 發明（設計）人: 廖萬清
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12Q1/18;C12R1/645
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 趙青

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種格特隱球菌(Cryptococcus?gattii）及其分離培養方法與應用。

背景技術

格特隱球菌(Cryptococcus?gattii）是一種帶有莢膜的擔子菌酵母，該菌主要分布于熱帶、亞熱帶地區，常感染免疫正常人群。分子分型表明，其由VGI-VGIV?4種主要基因型構成。其中，VGII基因型曾在加拿大溫哥華島引起隱球菌腦膜炎的暴發流行。而我國則以新生隱球菌為隱球菌腦膜炎的主要致病菌。

隨著系統進化研究的深入，新生隱球菌格特變種現已上升至種的水平，命名為格特隱球菌(Kwon-Chung?KJ,Boekhout?T，Fell,JW，Diaz?M.Proposal?to?conserve?the?name?Cryptococcus?gattii?against?C.hondurianus?and?C.basillisporus(Basidiomycota,Hymenomycetes,Tremellomycetidae).Taxon,2002,51(4):804-806.)。

目前，我國仍缺少格特隱球菌流行病學、毒力和診治方面的研究。

發明內容

本發明的目的在于分離培養純化一株格特隱球菌(Cryptococcus?gattii）S8012菌株，并提供其分離培養純化方法，以及該菌株在篩選抗真菌藥物中的應用。

在本發明的菌株S8012發現以前，我國沒有分離純化的格特隱球菌。

本發明提供了一株格特隱球菌(Cryptococcus?gattii)，已于2012年4月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC?No.6018，保藏中心建立分類命名為：新型隱球酵母格特變種(Cyptococcus?neoformans?var.gattii)。

S8012菌株由長征醫院皮膚科首次從一名43歲男性隱球菌腦膜炎患者的腦脊液中分離得到，其表型與中國常見的導致隱球菌腦膜炎的新生隱球菌有很大區別。通過M13單引物PCR擴增指紋分析和ITS、IGS1、RPB1、RPB2、LAC1和TEF1多位點分析顯示該菌為格特隱球菌VGI型，與澳大利亞桉樹中分離的格特隱球菌同源。在20世紀初，中國上海、浙江、廣東、廣西、江西和云南省份曾從澳大利亞引進過赤桉（Eucalyptus?camaldulensis），這說明格特隱球菌可能是隨著桉樹的引進而進入我國。

本發明的格特隱球菌S8012，屬擔子菌門（Basidiomycota），銀耳綱（Tremellomycetes），銀耳目（Tremellales）,銀耳科（Tremellaceae）線黑粉菌屬（Filobasidiella）。

1.形態特征：

腦脊液墨汁染色可見帶寬闊莢膜的棒形、針形、梭形及瓢形等菌體形態。

2.培養特征：

沙氏培養基上30℃培養，次日開始生長，菌落為乳白色，光滑微濕潤，邊緣整齊，中央微高，隨培養時間延長由菌落由乳白色轉為桔黃色。馬鈴薯瓊脂及米粉吐溫80瓊脂培養基培養無子囊孢子，無菌絲。咖啡酸培養基上菌落呈黑色。該菌可使刀豆氨酸甘氨酸溴麝香草酚藍瓊脂培養基(CGB)培養基變藍。CGB培養基：制備甲液（甘氨酸10g,KH₂PO₄1g,MgSO₄1g,thiamine?HCl?1mg,L-canavanin?sulphate?30mg,H₂O?100ml,溶解各成分，pH?5.6,0.22μm濾膜除菌）和乙液（溴百里酚藍0.4g，0.01mol/L?NaOH?64ml,H₂O?36ml）。H₂O?880ml，乙液20ml，瓊脂20g，121℃高壓滅菌15min，冷卻到48℃后加甲液100ml，充分混合，制成平板或斜面。

3.碳源利用：

糖發酵不產生CO₂。可同化葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、山梨糖。尿素試驗陽性。

本發明的菌株經ITS1、5.8S?rDNA和ITS2區擴增測序方法：

采用真菌通用引物

上游引物ITS5：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’(如SEQ?ID?NO:1所示)；