[發明專利]胰蛋白酶法從腸粘膜提取肝素鈉的工藝

有效

• 申請號: 201210347349.3
• 申請日: 2012-09-19
• 公開（公告）號: CN103183748A
• 公開（公告）日: 2013-07-03
• 發明（設計）人: 花瑞華;潘為群;潘為中
• 申請（專利權）人: 杭州龍揚生物科技有限公司
• 主分類號: C08B37/10
• 分類號: C08B37/10
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏

技術領域

本發明涉及肝素鈉生產技術領域，特別涉及一種胰蛋白酶法從腸粘膜提取肝素鈉的工藝。

背景技術

肝素鈉又稱肝素，是一種含有硫酸基的酸性粘多糖類天然抗凝血物質。肝素鈉為白色或類白色粉末，無臭無味，有引濕性，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮、二氧六環等有機溶劑。

肝素鈉廣泛存在于哺乳動物肝、肺、腸黏膜中，多與蛋白質結合成復合體存在。酶解蛋白可分離肝素鈉，肝素鈉是含硫酸、氨基、醛糖酸的粘多糖。在pH8-9時，帶負電荷，可與陰離子交換劑進行離子交換，進行粗分離，多糖液在高濃度乙醇中沉淀進行精純。???????肝素鈉是血液化學成分測定中最好的抗凝劑。肝素鈉是一種含硫酸基團的黏多糖，分子量為1.5萬，其抗凝機制是與抗凝酶Ⅱ一起，在低濃度能抑制因子Ⅸa、Ⅷ和PF3之間的作用，并能加強抗凝血酶Ⅲ滅活絲氨酸蛋白酶，從而阻止凝血酶形成；還有抑制凝血酶的自我催化及抑制因子X的作用。

傳統的肝素鈉的酶解生產方法的缺陷是：生產周期長，能耗大，收率低，生產一億國際單位肝素鈉粗品需2800-3000根豬小腸的粘膜，產品純度低，肝素鈉的效價至多為80U/mg，并產生大量的腸渣和廢水，污染環境。CN1308088A的發明公開了一種利用生物發酵工藝生產肝素鈉的方法。該方法采用2709蛋白酶作為催化劑，D204強堿性陰離子交換樹脂作為離子交換樹脂，并采用150-180目多層布篩進行過濾。2709蛋白酶為人工合成物，降低了肝素鈉產品的天然性，而且采用2709蛋白酶酶解，生產過程中產生的異味較大，污染環境。同時該方法的產品收率、純度也較低。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術存在的上述缺陷，提供一種胰蛋白酶法從腸粘膜提取肝素鈉的工藝，生產周期短，產品收率、純度較高，可以很大程度的減少生產過程中異味產生，利于環保，在提取中大大減少了人工合成物的使用，提高了產品的天然性。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：?

一種胰蛋白酶法從腸粘膜提取肝素鈉的工藝，所述的工藝步驟如下：

（1）胰蛋白酶酶液制備：取新鮮豬胰臟，去除表面殘留油脂，用絞肉機將其絞碎，將絞碎的豬胰臟：飽和石灰水=1:9-12的重量比例混合均勻得胰蛋白酶酶液。

（2）酶解：將豬小腸粘膜漿液加入酶解罐，豬小腸粘膜漿液為豬小腸粘膜：水=1:?2.5-4的重量比的混合物，向酶解罐中加入鹽度21°-24°的氯化鈉溶液調節酶解罐中料液的鹽度至5±0.5°，控制料液的pH在8.5±0.5；接著按每1000L料液加15±5kg的酶量向酶解罐內加入胰蛋白酶酶液，控制料液溫度在53±3℃，鹽度4.2±0.2°，pH?7.0±0.5保持3±0.5小時；最后升溫至85-88℃，保持20-25min得酶解液，過濾去殘渣。本步驟最后酶解液過濾去殘渣時，往往采用布袋過濾去殘渣，這樣效率往往較低，發明人通過實踐探索，發明了采用振動篩過濾去殘渣的方式，大大提高了過濾速度，提高了生產效率，是代替布袋過濾的好方法。

（3）吸附：將酶解液輸入吸附罐，降溫至57±3℃，加水調節鹽度至3.0±0.5°，控制pH?7.0-7.5，按每1000L酶解液加3-8kg的樹脂量，向吸附罐內加入羅門哈斯FPA98CL型樹脂，攪拌吸附6-8小時后，收集樹脂。

（4）洗滌：將收集的樹脂用水洗滌至pH為中性，再將樹脂放入鹽度4±1°、溫度55-60℃的氯化鈉溶液，攪拌至少1小時進行洗滌，其中，樹脂：氯化鈉溶液=1:1.3-1.7（w/v）。控制氯化鈉溶液溫度在55-60℃，便于將樹脂表面油脂類的附著物清洗干凈，便于洗脫。

（5）洗脫：將步驟（4）洗滌后的樹脂倒入洗脫罐中進行兩次洗脫，其中，第一次洗脫為：將樹脂加入到鹽度為21±1°、溫度55-60℃的氯化鈉溶液中攪拌至少3小時，樹脂：氯化鈉溶液=1:1-1.4（w/v）；第二次洗脫為：將第一次洗脫后的樹脂加入到鹽度為21±1°、溫度55-60℃的氯化鈉溶液中攪拌至少3小時，樹脂：氯化鈉溶液=1:0.8-1.2（w/v）；合并兩次收集的洗脫液。控制兩次洗脫洗脫時的氯化鈉溶液溫度在55-60℃，便于將油脂狀的肝素鈉從樹脂上洗脫下來，增加得率。

（6）沉淀：將步驟（5）收集到的洗脫液倒入沉淀罐中，攪拌條件下向沉淀罐中加入酒精度85±5°的酒精，酒精用量以實測沉淀罐中混合液的酒精度到45°-60°為準，靜置沉淀15小時以上，收集沉淀物。